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発明の名称 分析チップ
発行国 日本国特許庁(JP)
公報種別 公開特許公報(A)
公開番号 特開2007−71711(P2007−71711A)
公開日 平成19年3月22日(2007.3.22)
出願番号 特願2005−259380(P2005−259380)
出願日 平成17年9月7日(2005.9.7)
代理人 【識別番号】100105647
【弁理士】
【氏名又は名称】小栗 昌平
発明者 楊 博 / 境野 佳樹 / 唐木 英行
要約 課題
検体を採取した現場で、迅速かつ簡便に精度の高い分析データの取得を可能とする分析チップを提供すること。

解決手段
検体中の1以上の成分を分析するための一体化された分析チップであって、少なくとも(1)検体の前処理をする前処理要素、(2)非水溶性物質を前処理要素に配置して外力によって前処理要素で撹拌できる手段(3)前処理後の検体中の1以上の成分を分析することのできる1以上の乾式多層分析要素、及び(4)前記前処理要素と前記乾式多層分析要素とをつなぐ1つ以上の流路を含む、分析チップ。
特許請求の範囲
【請求項1】
前処理要素および乾式検査試薬を配置した反応部位を有し、両者を流路でつなぐマイクロチップにおいて、非水溶性物質を前処理要素に配置して外力によって前処理要素で撹拌できることを特徴とするマイクロチップ。
【請求項2】
前処理要素中に処理した検体液が毛細管力で反応部に供給することを特徴とする請求項1に記載のマイクロチップ。
【請求項3】
一つの前処理要素および複数の反応部位を有し、前処理要素と各反応部位を複数の同じ長さの分岐流路でつなぐ請求項1または2のいずれかに記載のマイクロチップ。
【請求項4】
前処理が、血球分離、溶血、希釈、タンパク質の分解/変性、又は内因性物質の除去である、請求項1から3に記載の分析チップ。
【請求項5】
流路が、等価直径1mm以下のマイクロ流路である、請求項1から4の何れかに記載の分析チップ。
【請求項6】
前処理要素、乾式多層分析要素、及び流路の3要素、または前処理要素及び乾式多層分析要素の2要素が、1つのカートリッジに含有されることによって一体化されている、請求項1から5の何れかに記載の分析チップ。
【請求項7】
前処理要素、及び流路のいずれかまたは両方が、微細加工技術を用いて基板の上またはその中に作られており、多層乾式分析要素が流路に接合されていることによって一体化されている、請求項1から6の何れかに記載の分析チップ。
【請求項8】
請求項1から7の何れかに記載の分析チップに検体を適用して、前処理要素、及び乾式多層分析要素の順に検体を通過させることを含む、検体の分析方法。
発明の詳細な説明
【技術分野】
【0001】
本発明は、血液、尿、体液、組織、細胞、食物、廃液、池水、河川水、海水、又は雨水などの検体中に含まれる各種成分を分析するための、一体化された分析チップ及び測定方法に関する。
【背景技術】
【0002】
血液、尿等を検体として人の病気を診断する方法は、人体を損ねることなく簡便に診断できる方法として、従来から長く行われてきている。
【0003】
この方法の一つとして、ウェットケミストリー分析法がある。ウェットケミストリー分析法は、いわゆる溶液試薬を用いる方法であって、歴史も古く、多数の検査項目について検出試薬が開発されており、測定機も簡易小型機から大型全自動機まで各種のものがある。ウェットケミストリーに使用される検体は、血漿、血清、尿等であって、通常全血をそのまま検体として使用することはない。
【0004】
ウェットケミストリー分析法では、保存期間中は試薬の安定性を考慮していくつかの群に分けておき、溶解、調製時に混合することもできるし、試薬添加の手順をいくつかのステップに分けることも可能である。更に、測定検体の数に応じて、適量の試薬を溶解、調製しておくことができるので、1回の測定当りの試薬コストも少なくて済む。ウェットケミストリー分析法では、多数の溶液の取扱を組み合わせて自動化することは複雑で厄介ではあるが、臨床検査機器の開発は歴史もあり、社会的な要請も高かったため、既に大・中・小いずれの処理能力を必要とする分野についても、効率良い自動機器が開発、実用化されている。しかしながら、ウェットケミストリー分析法では、開業医や、即時に診断結果を得ることが求められる救急病院などのニーズを満たせないことが多かった。
【0005】
他方、特定成分の検出に必要な試薬類が乾燥状態で含有されているいわゆるドライケミストリー分析法も開発されている。ドライケミストリー分析法では、定性・定量分析に必要な全ての試薬は、試薬紙、使い捨て電極および磁性体のような分析要素の中に組み込まれている。基本的には、1検体1項目の測定ができる使い捨て型であり、比較的微量の血液(約10μl)で、簡便に迅速に血液分析を行うことを可能としている。ドライケミストリー分析法を用いた分析装置は多数開発・商品化されており、富士ドライケム(富士写真フイルム(株)製)、エクタケム(米国、イーストマンコダック社製)、ドライラボ(コニカ(株)製)、スポットケム(京都第一化学(株)製)、レフロトロン(独国、ベーリンガーマンハイム社製)、セラライザー(米国、マイルズラボラトリー社製)等が市販されている。
【0006】
このように、乾式多層分析要素は、小型で、迅速かつ簡便に検体中の成分を分析するという観点からは、従来のウェットケミストリー分析法より優れており、一定の成果をあげることに成功したが、幾つかの問題点もあった。
【0007】
例えば、検体が全血であり、分析対象となる成分が血清中に含まれる成分、例えば乳酸デヒドロゲナーゼである場合、乳酸デヒドロゲナーゼを分析するための多層乾式分析要素としては特開昭62−93662号公報、特開昭62−228947号公報に記載の方法が利用できるが、該多層乾式分析要素に検体を直接供与するのではなく、事前に前処理(全血より血球成分を除去する操作)が必須となる。このような場合、血球分離要素が、前処理要素の一例として必要となる。
【0008】
例えば、検体が全血であり、分析対象となる成分が、ヘモグロビンA1C等の様に、血球中に存在する成分を分析する場合は、血清中成分を測定する場合とは異なり、血球を破壊する必要がある。ヘモグロビンA1Cを分析するための多層乾式分析要素としては、特開平9−166594号公報に記載の方法が利用できるが、該乾式分析要素に検体を直接供与するのではなく、事前に前処理(血球を破壊する操作)が必要となる。このような場合、血球を破壊する要素が前処理要素の一例として必要となる。
【0009】
例えば、いわゆる抗原抗体反応を用いるイムノアッセイにおいては、抗原抗体反応を速やかに進行させる目的から、検体(主に血漿)を希釈する必要がしばしばある。例えば、多層乾式免疫分析要素としては、特開平1−237455号公報、特開平1−321360号公報、特開平1−321361号公報に記載の方法があるが、これらの多層乾式免疫分析要素には検体を直接供与するのではなく、予め希釈する必要が必要となる場合がしばしばある、このような場合希釈要素が前処理要素の一例として必要となる。
【0010】
例えば、糖化タンパク質(例えばグリコアルブミン、ヘモグロビンA1C等)のように、被分析物質が高分子量の物質である場合、あらかじめタンパク質分解酵素で分解処理したのち、分解生成物中の成分を分析することがある。このような場合タンパク質分解が前処理として必要となる。
【0011】
上述したように、検体を分析要素に供与する前に、何らかの前処理を必要とすることが多かった。このような前処理は測定操作を煩雑にし、測定精度を低下させるだけではなく、測定者が検体により汚染される可能性が高くなるという望ましくない状況を引き起こすことが多かった。
【0012】
近年微細加工技術を利用した微細加工チップ(マイクロチップ)が多数提案されてきている。この微細加工技術が前処理、反応検出などを一体化する便利な小型分析装置の作製を可能にする。
【0013】
特開2001−258868号公報には、血液を採取する手段と、血液からろ過して血漿を得るろ過する手段と、血液を分離して血清を得る分離する手段と、血液成分中のpH値、酸素濃度、二酸化炭素濃度、ナトリウム濃度、カリウム濃度、カルシウム濃度、グルコース濃度、乳酸濃度を分析する手段を小型一体にまとめたヘルスケアデバイスが記載されている。
【0014】
しかし、マイクロ流体系においては、搬送される流体が層流を形成するため検体と検出試薬の混合が困難であるという大きな欠点があった。
【0015】
特開2003-1077号公報には複数の分岐流路と、1又は2以上の第2分岐流路、互いに略平行に間隔を設けて層状に形成される。各分岐流路から出る液は層流になり、混合流路には、各層流が混合するようになる。
【0016】
特開2002-346355号公報には、異種の微量な液体(試料液と試薬液)は、導入流路内で合流した後に流路幅が拡大した混合流路に進入して互いに接触し合いながら分子拡散による混合が進み、さらにこの混合流路に沿ってその底面側に形成した凸状絞り部を通過するたびに通流方向および垂直方向の流速が繰り返し変化して発生した攪乱流によって混合が効果的に促進される。
【0017】
特開2001-252897号公報には、マイクロ分析チップのサンプル液と試薬液の混合部に、光照射により生ずる光圧を駆動力として回転する光圧ミキサが配設されたものである。これにより、レーザ光等が照射された光圧ミキサは、混合部において回転し、サンプル液及び試薬液に対流を誘起して、二液を能動的かつ直接に混合撹拌する。
【0018】
いずれの方法も、連続的な送液による混合であり、一定量、バッチ系での混合をするという使用目的には適さない。
また、液の搬送は微量ポンプと他の外力によって実行する。特開2003−28883号公報には、プラットフォームの回転から生じる向心力を利用して液搬送を行うシステムが開示されている。いずれの場合にも、ポンプ、遠心機などの周辺機器が必要になるので、装置の大型化と高価にもたらす。
【0019】
【特許文献1】特開昭62−93662号公報
【特許文献2】特開昭62−228947号公報
【特許文献3】特開平9−166594号公報
【特許文献4】特開平1−237455号公報
【特許文献5】特開平1−321360号公報
【特許文献6】特開平1−321361号公報
【特許文献7】特開2001−258868号公報
【特許文献8】特開2003-1077号公報
【特許文献9】特開2002-346355号公報
【特許文献10】特開2001-252897号公報
【特許文献11】特開2003−28883号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0020】
本発明の目的は、採取した検体を現場で、迅速かつ簡便に前処理し、精度の高い分析データの取得を可能とする分析チップを提供することである。そのために、前処理の中でも特に、時間を要する攪拌を迅速に行うための手段を提供することである。本発明のもう一つの目的は、処理済みの検体液を送液ポンプ、減圧ポンプなどの周辺装置無しで、シンプルな毛細管力で検出部に送液することが可能な分析チップを提供することである。本発明の第三の目的は、処理済みの検体液を同時に複数の検出部に送液することが可能な分析チップを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0021】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、検体の前処理要素(例えば、溶血要素、希釈要素など)に混合要素を設け、前処理要素の中に非水溶性物質を配置して、外力によって攪拌できる手段を提供すること、この前処理要素は多層乾式分析要素を直接又は流路を介して連結して一体化すること、さらに、毛細管力をうまく利用し、処理後の検体液を精度良く分析要素に送液することにより、上記課題を解決した分析チップを提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。さらに、同時に複数の項目を分析する際に同じ長さの分岐流路によって、分析要素に同時に送液することができる分析チップを提供する。
【0022】
すなわち本発明によれば、検体中の1以上の成分を分析するための一体化された分析チップであって、少なくとも(1)検体の前処理をする前処理要素、(2)非水溶性物質を前処理要素に配置して外力によって前処理要素で撹拌できる手段(3)前処理後の検体中の1以上の成分を分析することのできる1以上の乾式多層分析要素、及び(4)前記前処理要素と前記乾式多層分析要素とをつなぐ1つ以上の等長流路を含む、分析チップが提供される。
【0023】
非水溶性物質を前処理要素に配置して外力によって前処理要素で撹拌できることを特徴とするマイクロチップが提供される。
【0024】
前処理要素中に処理した検体液が毛細管力で反応部に供給することを特徴とする分析微小チップ。
【0025】
前処理要素中に処理した検体液を同時に複数の反応部に供給できるために、前処理要素とつながる主流路から等長の分岐流路を設置することを特徴とする分析微小ップ。
【0026】
好ましくは、前処理は、血球分離、溶血、希釈、タンパク質の分解/変性、又は内因性物質の除去である。
【0027】
好ましくは、流路は、等価直径1mm以下のマイクロ流路である。
【0028】
好ましくは、前処理要素、乾式多層分析要素、及び流路の3要素、または前処理要素及び乾式多層分析要素の2要素が、1つのカートリッジに含有されることによって一体化されている。
好ましくは、前処理要素、及び流路のいずれかまたは両方は、微細加工技術を用いて基板の上またはその中に作られており、多層乾式分析要素が流路に接合されていることによって一体化されている。
【0029】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の分析チップに検体を適用して、前処理要素、及び乾式多層分析要素の順に検体を通過させることを含む、検体の分析方法が提供される。
【発明の効果】
【0030】
本発明の分析チップによれば、微量の検体を用いて、該検体を実質的に前処理することなく、迅速、簡便かつ精度良く検体中の成分を分析することが可能である。本発明によれば、煩雑な前処理操作を必要としない分析チップが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【0031】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明は、検体中の1以上の成分を分析するための一体化された分析チップに関するものである。本発明の分析チップは、少なくとも(1)検体の前処理をする前処理要素、(2)非水溶性物質を前処理要素に配置して外力によって前処理要素で撹拌できる手段(3)前処理後の検体中の1以上の成分を分析することのできる1以上の乾式多層分析要素、及び(4)前記前処理要素と前記乾式多層分析要素とをつなぐ1つ以上の等長流路を含む。
【0032】
本発明において、「一体化」されているとは、上記分析チップに注入された検体中の成分が、該分析チップの外に出されることなく、全ての測定が完了できるということである。
【0033】
一体化してなる分析チップを構成する素材としては、ゴム、プラスチックなどの樹脂、シリコン含有物質が挙げられる。
プラスチックあるいはゴムとしては、例えば、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリサイクリックオレフィン(PCO)、ポリカーボネート(PC)、ポリスチレン(PS)、ポリエチレン(PE)、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリプロピレン(PP)、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、天然ゴム、合成ゴム及びこれらの誘導体が挙げられる。シリコン含有物質としては、ガラス、石英、シリコンウエファー等のアモルファスシリコン、ポリメチルシロキサンなどのシリコーンが挙げられる。
上記の中でも、PMMA、PCO、PS、PC、ガラス、シリコンウエファーが好ましい。
【0034】
チップの形、および大きさは、手で持ちやすい範囲であれば、いずれの形、大きさでもよい。具体的には、例えば、底面の一辺が10〜50mm位の長方形で、厚みが2〜10mm位のものが好ましい形および大きさとして挙げられる。
【0035】
チップの内部構造(処理要素、流路、反応部)を作成するための微細加工技術は、例えばマイクロリアクター −新時代の合成技術−(2003年 シーエムシー刊 監修:吉田潤一 京都大学大学院 工学研究科教授)、微細加工技術 応用編−フォトニクス・エレクトロニクス・メカトロニクスへの応用−(2003年 エヌ・ティー・エス刊 高分子学会行事委員会編)等に記載されている方法を挙げることができる。
【0036】
代表的な方法を挙げれば、X線リソグラフィを用いるLIGA技術、EPON SU−8を用いた高アスペクト比フォトリソグラフィ法、マイクロ放電加工法(μ−EDM)、Deep RIEによるシリコンの高アスペクト比加工法、Hot Emboss加工法、光造形法、レーザー加工法、イオンビーム加工法、およびダイアモンドのような硬い材料で作られたマイクロ工具を用いる機械的マイクロ切削加工法などがある。これらの技術を単独で用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。好ましい微細加工技術は、X線リソグラフィを用いるLIGA技術、EPON SU−8を用いた高アスペクト比フォトリソグラフィ法、マイクロ放電加工法(μ−EDM)、および機械的マイクロ切削加工法である。
【0037】
本発明における(1)および/または(3)(4)は、シリコンウエファー上にフォトレジストを用いて形成したパターンを鋳型とし、これに樹脂を流し込み固化させる(モールディング法)ことによっても作成することができる。モールディング法には、PDMSまたはその誘導体に代表されるシリコン樹脂を使用することができる。
【0038】
本発明のチップを組み立てる際、接合技術を用いることができる。通常の接合技術は大きく固相接合と液相接合に分けられ、一般的に用いられている接合方法は、固相接合として圧接や拡散接合、液相接合として溶接、共晶接合、はんだ付け、接着等が代表的な接合方法である。
【0039】
更に、組立に際しては高温加熱による材料の変質や大変形による流路等の微小構造体の破壊を伴わない寸法精度を保った高度に精密な接合方法が望ましく、その技術としてはシリコン直接接合、陽極接合、表面活性化接合、水素結合を用いた直接接合、HF水溶液を用いた接合、Au−Si共晶接合、ボイドフリー接着などが挙げられる。
また、超音波、レーザー等を用いる接合、接着剤、接着テープなども使用する接合を使用してもよいし、単に圧力だけで、接合していてもよい。
【0040】
次に前記要素のうち、前処理要素について説明する。
本発明における前処理とは、採取した検体を乾式分析要素に供与する前に必要なすべての処理操作およびその一部分を示す。前処理要素は検体の前処理作業をする要素のことをいう。前処理作業の例としては、血球分離、溶血、希釈、タンパク質の分解/変性、内因性物質の除去等をあげることができる。
【0041】
前処理要素は、通常は前処理要素を構成する部材と、前処理を行うための試薬より構成ざれている。前処理要素を構成する部材はカートリッジに含有されていてもいいし、基板の上またはその中につくられていてもいい。
【0042】
前処理要素は、いわゆる流路と同じ構造をしていてもよいが、反応を速やかに進行させるという意味から、多孔質体である場合もある。ここでいう多孔質体の例としては、濾紙、メンブラン、ガラス繊維、ガラス繊維濾紙、繊維、不織布等、及びその組み合わせを挙げることができる。
【0043】
また、前処理要素は、ビーズのような微粒子によって構成されていてもいい。ここでいう微粒子の例としては、ガラスビーズ、シリコンビーズ、ポリマービーズ、ラテックスビーズ、ナノ粒子、磁性粒子、アモルファスシリコンビーズなど、及びその組み合わせを挙げることができる。このようなビーズの例としては、特開2004-61496号公報、特開平5-87812号公報に記載の方法等が使用できる。
【0044】
また、前処理要素は、固体基板上に前述したような微細加工技術により作成することもできる。この場合、前処理要素は、前述したような微細加工技術により実質的に多孔質になっていてもよい。この場合、前処理要素はピラー状になっていることも好ましい。
【0045】
前処理に必要な試薬が必要な場合、前処理要素は、前処理要素内に該前処理用試薬を保持していることが望ましい。前処理試薬を前処理要素に導入する方法としては、スポット法、スクリーン印刷法、ナノコンタクトプリンティング法、インクジェット法等が利用できる。また、あらかじめ、ポリエチレンテレフタレートや、酢酸セルロース誘導体等で作られたベース上に塗布したのち、該前処理要素に接着してもよい。また、前述したような多孔質体に含有(または吸着、固定化、分散等)させたのち、該前処理要素に導入してもよい。
【0046】
本発明でいう前処理の具体例の一つとしては、血球分離作業をあげることができる。
本発明において、全血より血漿を分離する要素の形態は、血球分離が可能ならばいずれの形でもよく、直線状、曲線状等、いずれの形態をとることも可能である。
また、本発明において、分離要素としては、従来公知の血球分離のいずれの方法も利用することができる。例えば、遠心力を利用する要素、濾過による要素等を挙げることができる。また、これらを組み合わせてもよい。
【0047】
遠心力を利用する要素の場合、血液分析チップに全血を注入し、遠心分離機によりチップを回転させ血漿を分離し、分離した血漿を流路を通して乾式多層分析要素に導くことができる。遠心力を利用する要素としては、前記のとおり、遠心分離機を利用することができる形態を持ち、かつ血漿を分離し、分離した血漿を流路を通して乾式多層分析要素に導くことができればいずれの形態であってもよい。例えば、血漿を分離した後の固体成分を配置する凹部を有する形態を好ましい具体例としてあげることができる。
【0048】
本発明においては、濾過による要素を用いることが好ましい。濾過に用いる濾材としては、濾過に用いられる従来公知のいずれのものも利用可能であるが、多孔質体であることが好ましく、該多孔質体としては、濾紙、メンブラン、ガラス繊維、ガラス繊維濾紙等があげられる。また、これらを組み合わせてもよい。また、例えば、特開平11−6829号公報、特開平11−38001号公報、特開平11−38002号公報、特開平11−38003号公報、特開平11−237378号公報等の各公報に記載の方法を使用することもできる。
また、例えば、微細加工技術を利用したマイクロピラー型のものであってもよい。
【0049】
血液濾過ユニットで使用される血液濾過材では、その表面のみで血球をトラップする訳ではなく、ガラス繊維濾紙の厚さ方向に浸透するに従って、厚さ方向に全長にわたって血球を留め除去していく、いわゆる体積濾過作用によるものと理解される。
【0050】
上記血液濾過ユニットで使用される血液濾過材は特開昭62−138756号公報、特開昭62−138757号公報、特開昭62−138758号公報、特開平2−105043号公報、特開平3−16651号公報等に開示された方法に従って各層を部分的に配置された接着剤で接着して一体化することができる。
【0051】
以上に述べてきた、上記(1)に使用する要素は、後述する全血を注入する要素と、乾式多層分析要素の間に配置されることが好ましいが、(1)の要素が全血を注入する要素を兼ねてもよい。また、上記(1)に使用する要素は、流路によりつながっていても、または流路内に組込まれていてもよい。
【0052】
本発明でいう前処理の別の具体例としては、溶血処理を挙げることができる。検体が全血でありかつ、分析対象となる物質が血球中に含まれる成分の場合、前処理として血球の破壊つまり溶血作業が必要となる。例えば発明の測定対象がグリコヘモグロビン(HbA1 )である場合、検体中の赤血球を十分溶血させて、赤血球中のヘモグロビンが溶液中を可溶化させる必要がある。グリコヘモグロビンを検出するための多層乾式分析要素は、特開平9−166594号公報、特開平8−122335号公報等に記載されているが、これらの方法においても、該乾式多層分析要素に検体を供給する前に、血球を破壊する必要があった。本発明においては、このような溶血工程が前処理要素内でおこなえるようにすることにより、著しい性能の改善を期待することができる。
【0053】
このような、溶血工程が前処理として必要な場合、前処理要素は、前述したような多孔質であることが望ましいが、流路内に溶血試薬を担持しているだけでもよい。溶血試薬は、乾燥させるか、または溶液状態であるかいずれかの方法で担持することができる。
【0054】
溶血試薬としては、市販の溶血剤や界面活性剤(例えばTriton X-100)で溶血させる方法、非等張希釈液を使用して浸透圧ショックで溶血させる方法等を挙げることができる。また必要に応じ、超音波処理で赤血球膜を破壊してもよい。
【0055】
溶血試薬として使用できる界面活性剤としては、特開平6-11510号公報に記載された、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)やジオクチルスルホ琥珀酸ナトリウム(DONS)などのアニオン性界面活性剤、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド(TTAB)やセチルトリメチルアンモニウムブロミド(CTAB)などのカチオン性界面活性剤、カルボキシベタイン型などの両性界面活性剤などがある。また、ノニオン性界面活性剤としては、p-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェノキシポリエトキシエタノール(オキシエチレン単位平均 9〜10含有 Triton X-100; オキシエチレン単位平均16含有 Triton X-165; オキシエチレン単位平均40含有 Triton X-405、いずれもChemical Abstract Registry No. 9002-93-1)のようなアルキルフェノールポリエチレンオキシド縮合物;p-ノニルフェノキシポリグリシドール(グリシドール単位平均10含有)のようなアルキルフェノールポリグリシドール縮合物;ラウリルアルコールポリエチレンオキシド縮合物(例えばBrij 35 、Chemical Abstract Registry No. 9002-92-0);セチルアルコールポリエチレンオキシド縮合物(例えばBrij 58、Chemical Abstract Registry No. 9004-95-9)のような高級脂肪族アルコールのポリエチレンオキシド縮合物;ステアリン酸エステルポリエチレングリコール縮合物(例えばMyrj 52、 Myrj 59、いずれもChemical Abstract Registry No. 9004-99-3)のようなポリエチレングリコールの高級脂肪酸エステル縮合物;ソルビタンモノラウリン酸エステルのポリエチレングリコール縮合物(例えばTween 20、Chemical Abstract Registry No. 9005-64-5)のような高級脂肪酸ソルビタンエステルのポリエチレングリコール縮合物等がある。
【0056】
本発明でいう前処理のさらに別の具体例としては、希釈処理を挙げることができる。検体中の成分を分析する方法が、免疫学的測定法、例えば酵素免疫測定法を用いる分析法である場合、検体を一定倍率で希釈する必要がしばしば生じる。乾式多層酵素免疫法については、例えば特開平5−232112号公報等の方法が開示されている。これらの方法においても、検体が血清である場合、検体の希釈はしばしば必要である。
【0057】
検体の希釈は、血清中の微量物質を測定するための免疫測定法において、共存蛋白質による免疫反応の阻害や、非特異的な吸着による測定データの信頼性の低下を防止する効果をもつ。また、酵素反応を利用するいわゆる酵素免疫測定法においては、いわゆる定量的に測定できる濃度範囲(検量域)が広くないことが多い。このような場合、検体を希釈することにより、検体中に含まれる測定物質の濃度を検量域内におさめることができる。
【0058】
検体の希釈は、通常は検体と希釈液を混ぜることにより行われる。希釈液は、検出反応に適したpHの緩衝液を利用することが多い。また、塩濃度を調節するために塩化ナトリウム等の塩を添加してもよい。緩衝液としては、通常の生化学反応に使用される全ての緩衝液を利用することが可能であり、例えばリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、TRIS緩衝液、MES緩衝液、HEPES緩衝液等を挙げることができる。
【0059】
希釈操作が前処理である場合、前処理要素は該希釈液を含有していてもいい。また、希釈液を保持する要素を別に作り、該要素と前処理要素を流路等で連結することにより、検体と該希釈液を、前処理要素内で混合してもいい。
前処理要素は、検体と希釈液が混合しやすいような形態をとっていることが好ましい。
【0060】
本発明でいう前処理のさらに別の具体例としては、蛋白質の分解が挙げられる。分析されうる物質が蛋白質である場合、該蛋白質をあらかじめ蛋白質分解酵素により限定分解したのち分析要素に供給することがある。このような場合、蛋白質分解工程が前処理となる。
【0061】
例えば、糖化タンパク質を検出する場合、検体中の対象となる糖化タンパク質を、プロテアーゼ等により分解したのち、プロテアーゼ処理物中の糖化アミノ酸を、糖化アミノ酸酸化酵素等により、生成した過酸化水素を検出することにより、該糖化タンパク質を検出することができる。このような方法は、例えば特開2001-54398号公報、特開平11−155596号公報に記載されている。このようなタンパク質の例としては例えば、糖化アルブミン、糖化グロブリン、糖化ヘモグロビン、糖化カゼイン等があげられる。また、検体としては、例えば、血液、血清、血漿、牛乳、醤油等あげられる。
【0062】
本発明のタンパク質の分解に使用しうるプロテアーゼは、被検液に含まれるタンパク質に有効に作用するものであればいかなるものを用いてもよく、例えば動物、植物、微生物由来のプロテアーゼ等が挙げられる。具体的な例を以下に示すがこれらは1例に過ぎず、なんら限定されるものではない。
【0063】
動物由来のプロテアーゼの例としては、エラスターゼ(Elastase)、トリプシン(Tripsin) 、キモトリプシン(Chymotripsin)、ペプシン(Pepsin)、牛膵臓プロテアーゼ、カテプシン(Cathepsin) 、カルパイン(Calpain) 、プロテアーゼタイプ-I、プロテアーゼタイプ-XX(以上シグマ社製)、アミノペプチダーゼM (AminopeptidaseM)、カルボキシペプチダーゼA(Carboxypeptidase A)(以上ベーリンガー・マンハイム社製)、パンクレアチン(Pancreatin :和光純薬製)等が挙げられる。
【0064】
植物由来のプロテアーゼの例としては、カリクレイン(Kallikrein)、フィシン(Ficin) 、パパイン(Papain)、キモパパイン(Chimopapain) 、ブロメライン(Bromelain)(以上シグマ社製)、パパインW-40、ブロメラインF(以上天野製薬社製)等が挙げられる。
【0065】
微生物由来のプロテアーゼの例としては、下記 (1)〜(14)が挙げられる。
(1) バチルス(Bacillus)属由来プロテアーゼ;ズブチリシン(Subtilisin)、プロテアーゼ−タイプ -VIII、-IX 、-X、-XV 、-XXIV 、-XXVII、−XXXI(以上、シグマ社製)、サーモリシン(thermolysin) 、ナガーゼ(Nagarse)(以上、和光純薬社製)、オリエンターゼ-90N、-10NL 、-22BF 、-Y、-5BL、ヌクレイシン(以上、阪急バイオインダストリー社製)、プロレザー、プロテアーゼ-N、-NL 、-S「アマノ」(以上、天野製薬社)、GODO-BNP、-BAP (以上、合同酒清社精製)、プロチン-A、-P、デスキン、デピレイス、ビオソーク、サモアーゼ(以上、大和化成社製)、トヨチームNEP(東洋紡績社製)、ニュートラーゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、デュラザイム、バイオフィードプロ、アルカラーゼ、NUE 、ピラーゼ、クリアーレンズプロ、エバラーゼ、ノボザイム-FM 、ノボラン(以上、ノボノルディスクバイオインダストリー社製)、エンチロン-NBS、-SA(以上、洛東化成工業社製)、アルカリプロテアーゼ GL440、オプティクリーン -M375プラス、-L1000、-ALP440(以上、協和発酵社製)、ビオプラーゼAPL-30、SP-4FG、XL-416F 、AL-15FG(以上、ナガセ生化学工業社製)、アロアーゼAP-10 、プロテアーゼY、(以上、ヤクルト薬品工業社製)、コロラーゼ-N、-7089 、ベロンW(以上、樋口商会社製)、キラザイム P-1(ロシュ社製)等。
【0066】
(2) アスペルギルス(Aspergillus) 属由来プロテアーゼ;プロテアーゼタイプ−XIII, -XIX, -XXIII (以上、シグマ社製)、スミチーム -MP、-AP 、-LP 、-FP 、LPL, エンザイムP-3(以上、新日本化学工業株式会社製)、オリエンターゼ-20A、-ONS、-ON5、テトラーゼS(以上、阪急バイオインダストリー社製)、ニューラーゼA、プロテアーゼ-A、-P、-M「アマノ」(以上、天野製薬社)、IP酵素、モルシンF、AOプロテアーゼ(以上、キッコーマン社製)、プロチン-F、-FN 、-FA(以上、大和化成社製)、デナプシン2P、デナチーム -SA-7、-AP 、デナザイム AP(以上、ナガセ生化学工業社製)、プロテアーゼYP-SS 、パンチダーゼ -NP-2、-P (以上、ヤクルト社製)、サカナーゼ(科研ファルマ社製)、フレーバーザイム(ノボノルディスクバイオインダストリー社製)、ベロンPS(樋口商会社製)等。
【0067】
(3) リゾパス(Rhizopus)属由来プロテアーゼ;プロテアーゼタイプ XVIII (シグマ社製)、ペプチダーゼR、ニューラーゼF(以上、天野製薬社製)、XP-415(ナガセ生化学工業社製)等。
(4) ペニシリウム(Penicillium) 属由来プロテアーゼ;PD酵素(キッコーマン社製)等。
(5) ストレプトマイセス(Streptomyces)属由来プロテアー;プロテアーゼ−タイプ XIV;別称 Pronase、-XXI (以上、シグマ社製)、アクチナーゼ -AS、-AF(以上、科研ファルマ社製)、タシナーゼ(協和発酵社製)、alkalofilicproteinase(東洋紡社製)等。
【0068】
(6) スタフィロコッカス(Staphylococcus)属由来プロテアーゼ;プロテアーゼタイプXVII (シグマ社製)等。
(7) クロストリジウム(Clostridium) 属由来プロテアーゼ;クロストリパイン(Clostripain)、ノンスペシフィック ニュートラルプロテアーゼ(nonspesificproteinase) (以上、シグマ社製)等。
(8) リソバクター(Lysobacter)属由来プロテアーゼ;エンドプロテイナーゼLys-c(シグマ社製)等。
【0069】
(9) グリフォラ(Grifola) 属由来プロテアーゼ;メタロエンドペプチダーゼ(Metalloendopeputidase; シグマ社製)等。
(10) 酵母(Yeast) 属由来プロテアーゼ;プロテイナーゼA(Proteinase A;シグマ社製)、カルボキシペプチダーゼY(carboxypeptid aseY; ベーリンガー・マンハイム社製)等。
(11) トリチラチウム(Tritirachium)属由来プロテアー;プロテイナーゼK(Proteinase K;シグマ社製)等。
【0070】
(12) サーマス(Thermus) 属由来プロテアーゼ;アミノペプチダーゼT(Aminopeptidase T;ベーリンガー・マンハイム社製)等。
(13) シュードモナス(Pseudomonus) 属由来プロテアーゼ;エンドプロテイナーゼAsp-N(EndoproteinaseAsp-N;和光純薬社製)等。
(14) アクロモバクター(Achromobacter) 属由来プロテアーゼ;リジルエンドペプチダーゼ(LysylEndopeputidase) 、アクロモペプチダーゼ(以上和光純薬社製)等。
【0071】
タンパク質分解工程においては、タンパク質分解酵素が使用されることが多い。このような酵素の種類は特に制限されず、例えば、プロテアーゼK、ズブチリシン、トリプシン、アミノペプチダーゼ、糖化ペプチドプロテアーゼ等が使用できる。
【0072】
このような前処理工程に使用される酵素は、前処理要素に直接固定化されていてもいいし、また乾燥状態で含有されていてもよい。また、別の好ましい例としては、前述したような微粒子に担持した後に前処理要素内に含有させてもよい。
【0073】
酵素をチップ内に固定する方法としては、共有結合法、物理吸着法、イオン結合法等いずれの方法も用いることができる。特に、本発明の分析チップが、マイクロチップの形態を取る場合、例えば特開2004−125406号公報に記載した方法を利用することも好ましい。また、特開2004−61496号公報に記載されているように、ビーズ/微粒子に担持することも好ましい。
【0074】
本発明で言う前処理のさらに別の具体例としては、内因性物質の除去を挙げることができる。検体が例えば血清や、全血である場合、該検体中に含まれている成分(内因性物質)が目的とする成分の検出に影響を与えることがしばしばあり、分析要素に検体を供給する前に該内因性物質を除去したり、その活性を低下させる必要が生じる。このような場合、該内因性物質の除去が、前処理として必要になる。
【0075】
内因性物質の除去の方法としては、該物質が酵素である場合、該酵素に特異的に働く阻害剤により該酵素の活性を阻害する方法がある。例えば、酵素免疫測定法において、検出に利用する酵素(標識酵素)が検体内にも存在する場合、内因性の酵素が反応の検出を著しく阻害する場合がある。特開平1−237455号公報、特開平1−321360号公報、特開平1−321361号公報に記載されているような枯草菌のアミラーゼを標識酵素を使用する酵素免疫測定法の場合、血清中に存在するアミラーゼが検出の精度を低下させることがしばしばある。このような現象をふせぐため、血清中のアミラーゼに特異的な阻害剤を検体と反応させることにより、内因性のアミラーゼの影響を除去できる。
【0076】
また、内因性物質が酵素基質である場合、該内因性物質を予め酵素により分解したり、抗体等の特異的吸着物質により除去することができる。例えば、血清中に存在するアスコルビン酸(及びその誘導体)は、分析要素の酸化還元発色系に著しく影響を与えることがある。このような場合、予め内因性のアスコルビン酸を除去する必要がある。アスコルビン酸の除去には、主にアスコルビン酸酸化酵素を使用するが、また、特開平9-089867号公報、特開平07-303497号公報、特開平11-309466号公報等に記載の方法が利用できる。
【0077】
前処理が内因性物質の除去である場合、前処理要素は前述したよう該内因性物質そのものまたはその活性を除去する試薬を含有している必要がある。このような試薬は、前処理要素に直接固定化されていてもいいし、また乾燥状態で含有されていてもよい。また、別の好ましい例としては、微粒子に担持した後に前処理要素内に含有させてもよい。
【0078】
酵素をチップ内に固定する方法としては、共有結合法、物理吸着法、イオン結合法等いずれの方法も用いることができる。特に、本発明の分析チップが、マイクロチップの形態を取る場合、例えば特開2004−125406号公報に記載した方法を利用することも好ましい。また、特開2004−61496号公報に記載されているように、ビーズ/微粒子に担持することも好ましい。
【0079】
本発明では、検体中の成分を検出するための試薬を、多層乾式分析要素として、一体化された分析チップの検出系に使用する。乾式分析要素は、いわゆるドライケミストリーを使用した分析要素のことである。本発明では、一体化された分析チップの検出系に、多層乾式分析要素を使用することにより、試薬が乾燥状態で安定であること、検体の水分だけで反応が進行することによって、迅速に検出が可能となる。
【0080】
本発明でいう多層乾式分析要素とは、血液中の非測定成分の定性・定量分析に必要な全てのまたはその一部分の試薬を1層以上の層に組み込んだ乾式分析要素のことをいう。いわゆるドライケミストリーを使用した分析要素である。具体的には、このような多層乾式分析要素の例は、富士フイルム研究報告、第40号(富士写真フイルム株式会 社、1995年発行)p.83や、臨床病理、臨時増刊、特集第106号、ドライケミストリー・簡易検査の新たなる展開(臨床病理刊行会、1997年発行)等に記載されているものをあげることができる。
【0081】
上記した多層乾式分析要素は、通常少なくとも1つの機能層を含む。機能層の数は1以上であれば特に限定されず、1層でもよいし、2層以上の複数の層とすることもできる。
【0082】
機能層の具体例としては、展開層と機能層を接着する接着層、液状試薬を吸水する吸水層、化学反応により生成した色素の拡散を防止する媒染層、ガスを選択的に透過させるガス透過層、層間での物質移動を抑制・促進させる中間層、反射測光を安定に行うための光遮蔽層、内因性色素の影響を抑制する色遮蔽層、分析対象物と反応する試薬を含む試薬層、発色剤を含む発色層などが挙げられる。
【0083】
多層乾式分析要素の一例としては、例えば、支持体の上には、場合によっては下塗層等の他の層を介して、機能層として親水性ポリマー層を設けることができる。親水性ポリマー層としては、例えば、無孔性、吸水性かつ水浸透性の層であり、基本的に親水性ポリマーのみなる吸水層、親水性ポリマーをバインダーとし発色反応に直接関与する発色試薬の一部又は全部を含む試薬層、及び親水性ポリマー中に発色色素を固定し不動にする成分(例:媒染剤)を含有する検出層などを設けることができる。
【0084】
(試薬層)
試薬層は水性液体中の被検成分と反応して光学的に検出可能な変化を生じる試薬組成物の少なくとも一部が親水性ポリマーバインダー中に実質的に一様に分散されている吸水性で水浸透性の層である。この試薬層には指示薬層、発色層なども含まれる。
【0085】
試薬層のバインダーとして用いることができる親水性ポリマーは、一般には水吸収時の膨潤率が30%で約150%から約2000%、好ましくは約250%から約1500%の範囲の天然または合成親水性ポリマーである。そのような親水性ポリマーの例としては、特開昭60−108753号公報等に開示されているゼラチン(例、酸処理ゼラチン、脱イオンゼラチン等)、ゼラチン誘導体(例、フタル化ゼラチン、ヒドロキシアクリレートグラフトゼラチン等)、アガロース、プルラン、プルラン誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等をあげることができる。
【0086】
試薬層は架橋剤を用いて適宜に架橋硬化された層とすることができる。架橋剤の例として、ゼラチンに対する1,2−ビス(ビニルスルホニルアセトアミド)エタン、ビス(ビニルスルホニルメチル)エーテル等の公知のビニルスルホン系架橋剤、アルデヒド等、メタリルアルコールコポリマーに対するアルデヒド、2個のグリシジル基含有エポキシ化合物等がある。
【0087】
試薬層の乾燥時の厚さは約1μmから約100μmの範囲であることが好ましく、より好ましくは約3μmから約30μmの範囲である。また試薬層は実質的に透明であることが好ましい。
【0088】
乾式多層分析要素の試薬層やその他の層に含める試薬としては、被験物質に応じてその検出に適した試薬を選択することができる。
【0089】
(光遮蔽層)
前記試薬層の上に必要に応じて光遮蔽層を設けることができる。光遮蔽層は、光吸収性または光反射性(これらを合わせて光遮蔽性という。)を有する微粒子が少量の被膜形成能を有する親水性ポリマーバインダーに分散保持されている水透過性または水浸透性の層である。光遮蔽層は試薬層にて発生した検出可能な変化(色変化、発色等)を光透過性を有する支持体側から反射測光する際に、後述する展開層に点着供給された水性液体の色、特に試料が全血である場合のヘモグロビンの赤色等、を遮蔽するとともに光反射層または背景層としても機能する。
【0090】
光反射性を有する微粒子の例としては、二酸化チタン微粒子(ルチル型、アナターゼ型またはブルカイト型の粒子径が約0.1μmから約1.2μmの微結晶粒子等)、硫酸バリウム微粒子、アルミニウム微粒子または微小フレーク等を挙げることができ、光吸収性微粒子の例としては、カーボンブラック、ガスブラック、カーボンミクロビーズ等を挙げることができ、これらのうちでは二酸化チタン微粒子、硫酸バリウム微粒子が好ましい。特に好ましいのは、アナターゼ型二酸化チタン微粒子である。
【0091】
被膜形成能を有する親水性ポリマーバインダーの例としては、前述の試薬層の製造に用いられる親水性ポリマーと同様の親水性ポリマーのほかに、弱親水性の再生セルロース、セルロースアセテート等を挙げることができ、これらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等が好ましい。なお、ゼラチン、ゼラチン誘導体は公知の硬化剤(架橋剤)を混合して用いることができる。
【0092】
光遮蔽層は、光遮蔽性微粒子と親水性ポリマーとの水性分散液を公知の方法により試薬層の上に塗布し乾燥することにより設けることができる。また光遮蔽層を設ける代りに、前述の展開層中に光遮蔽性微粒子を含有させてもよい。
【0093】
(接着層)
試薬層の上に、場合によっては光遮蔽層等の層を介して、展開層を接着し積層するために接着層を設けてもよい。
【0094】
接着層は水で湿潤しているとき、または水を含んで膨潤しているときに展開層を接着することができ、これにより各層を一体化できるような親水性ポリマーからなることが好ましい。接着層の製造に用いることができる親水性ポリマーの例としては、試薬層の製造に用いられる親水性ポリマーと同様な親水性ポリマーがあげられる。これらのうちではゼラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等が好ましい。接着層の乾燥膜厚は一般に約0.5μmから約20μm、好ましくは約1μmから約10μmの範囲である。
【0095】
なお、接着層は試薬層上以外にも、他の層間の接着力を向上させるため所望の層上に設けてもよい。接着層は親水性ポリマーと、必要によって加えられる界面活性剤等を含む水溶液を公知の方法で、支持体や試薬層等の上に塗布する方法などにより設けることができる。
【0096】
(吸水層)
乾式多層分析要素には、支持体と試薬層の間に吸水層を設けることができる。吸水層は水を吸収して膨潤する親水性ポリマーを主成分とする層で、吸水層の界面に到達または浸透した水性液体試料の水を吸収できる層であり、全血試料を用いる場合には水性液体成分である血漿の試薬層への浸透を促進する作用を有する。吸水層に用いられる親水性ポリマーは前述の試薬層に使用されるもののなかから選択することができる。吸水層には一般的にはゼラチンまたはゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、特に前述のゼラチン又は脱イオンゼラチンが好ましく、試薬層と同じ前述のゼラチンが最も好ましい。吸水層の乾燥時の厚さは約3μmから約100μm、好ましくは約5μmから約30μmの範囲、被覆量では約3g/m2から約100g/m2、好ましくは約5g/m2から約30g/m2の範囲である。吸水層には後述するpH緩衝剤、公知の塩基性ポリマー等を含有させて使用時(分析操作実施時)のpHを調節することができる。さらに吸水層には公知の媒染剤、ポリマー媒染剤等を含有させることができる。
【0097】
(検出層)
検出層は、一般に、被検成分の存在下で生成した色素等が拡散し、光透過性支持体を通して光学的に検出され得る層で、親水性ポリマーにより構成することができる。媒染剤、例えばアニオン性色素に対してカチオン性ポリマーを、含んでもよい。吸水層は、一般に、被検成分の存在下で生成する色素が実質的に拡散しないような層を言い、この点で検出層とは区別される。
【0098】
多層乾式分析要素は、公知の方法により調製することができ、一辺約5mmから約30mmの正方形またはほぼ同サイズの円形等の小片に裁断して用いることができる。
【0099】
このような多層乾式分析要素はすでに多数開発・商品化されており、富士ドライケム(富士写真フィルム(株)製)などはその1例である。本発明においては、このような多層乾式分析要素そのものを使用する。またはその一部分を使用することもできる。
【0100】
上記多層乾式分析要素は、上記流路の少なくとも1つに接触していれば、該多層乾式分析要素と流路とがつながっている形態でも、該多層乾式分析要素が流路内に組み込まれている形態でもよく、また多層乾式分析要素を複数用いる場合には、流路でつながれた1箇所にまとめても、各分析要素を別々に配列してもよい。
多層乾式分析要素は、その最上層に血液またはその成分を水平方向に展開するいわゆる展開層を有することが多い。しかし、本発明においては、このような展開層は必ずしも必要ではない。
【0101】
本発明において、多層乾式分析要素と前処理要素をつなぐ流路を組込むことが可能である。従って、流路の幅は必要に応じて広い場合も狭い場合も考えられる。しかし、検体量が少ない場合は、マイクロ流路(等価直径1mm以下の流路)であることが望ましい。
本発明でいう等価直径(equivalent diameter)は、相当(直)径とも呼ばれ、機械工学の分野で一般的に用いられている用語である。任意断面形状の配管(本発明では流路に当たる。)に対し等価な円管を想定するとき、その等価円管の直径を等価直径といい、deq:等価直径は、A:配管の断面積、p:配管のぬれぶち長さ(周長)を用いて、deq=4A/pと定義される。円管に適用した場合、この等価直径は円管直径に一致する。等価直径は等価円管のデータを基に、その配管の流動あるいは熱伝達特性を推定するのに用いられ、現象の空間的スケール(代表的長さ)を表す。等価直径は、一辺aの正四角形管ではdeq=4a2/4a=a、路高さhの平行平板間の流れではdeq=2hとなる。これらの詳細は「機械工学事典」((社)日本機械学会編1997年、丸善(株))に記載されている。
【0102】
本発明に用いられるマイクロ流路の等価直径は1mm以下であるが、好ましくは10〜500μmであり、特に好ましくは20〜300μmである。
【0103】
また流路の長さには特に制限はないが、好ましくは1mm〜10000mmであり、特に好ましくは5mm〜100mmである。
【0104】
本発明に用いられる流路の幅は、1〜3000μmであることが好ましく、より好ましくは10〜2000μmであり、さらに好ましくは50〜1000μmである。流路の幅が上記範囲であると、血液などの検体が、流路の壁から抵抗を受けて流動性が低下することが少なく、かつ、検体の量を少量にとどめることができるため、好ましい。
【0105】
流路は一体型分析チップに配置する要素の数に合わせて、1つのみでも、2つ以上に分岐していてもいずれでもよい。また、直線状、曲線状など、いずれの形態をとることも可能であるが、直線状であることが好ましい。
【0106】
本発明の一体型分析チップおよび流路は、固体基板上に微細加工技術により作成することもできる。
【0107】
固体基板として使用される材料の例としては、金属、シリコン、テフロン(登録商標)、ガラス、セラミックスおよびプラスチックなどが挙げられる。中でも、金属、シリコン、テフロン(登録商標)、ガラスおよびセラミックスが、耐熱、耐圧、耐溶剤性および光透過性の観点から好ましく、特に好ましくはガラスである。
【0108】
流路を作成するための微細加工技術は、例えばマイクロリアクター −新時代の合成技術−(2003年 シーエムシー刊 監修:吉田潤一 京都大学大学院 工学研究科教授)、微細加工技術 応用編−フォトニクス・エレクトロニクス・メカトロニクスへの応用−(2003年 エヌ・ティー・エス刊 高分子学会 行事委員会編)等に記載されている方法を挙げることができる。
【0109】
代表的な方法を挙げれば、X線リソグラフィを用いるLIGA技術、EPON SU−8を用いた高アスペクト比フォトリソグラフィ法、マイクロ放電加工法 (μ−EDM)、Deep RIEによるシリコンの高アスペクト比加工法、Hot Emboss加工法、光造形法、レーザー加工法、イオンビーム加工法、 およびダイアモンドのような硬い材料で作られたマイクロ工具を用いる機械的マイクロ切削加工法などがある。これらの技術を単独で用いても良いし、組み合わせて用いても良い。好ましい微細加工技術は、X線リソグラフィを用いるLIGA技術、EPON SU−8を用いた高アスペクト比フォトリソグラフィ法、マ イクロ放電加工法(μ−EDM)、および機械的マイクロ切削加工法である。
【0110】
本発明に用いられる流路は、シリコンウエファー上にフォトレジストを用いて形成したパターンを鋳型とし、これに樹脂を流し込み固化させる(モールディン グ法)ことによっても作成することができる。モールディング法には、ポリジメチルシロキサン(PDMS)またはその誘導体に代表されるシリコン樹脂を使用 することができる。
【0111】
本発明の一体型分析チップを組み立てる際、接合技術を用いることができる。通常の接合技術は大きく固相接合と液相接合に分けられ、一般的に用いられている接合方法は、固相接合として圧接や拡散接合、液相接合として溶接、共晶接合、はんだ付け、接着等が代表的な接合方法である。
【0112】
更に、組立に際しては高温加熱による材料の変質や大変形による流路等の微小構造体の破壊を伴わない寸法精度を保った高度に精密な接合方法が望ましく、その技術としてはシリコン直接接合、陽極接合、表面活性化接合、水素結合を用いた直接接合、HF水溶液を用いた接合、Au−Si共晶接合、ボイドフリー接着などが挙げられる。
【0113】
検体は流路から多層乾式分析要素まで移動する。流路内の検体、すなわち流体を扱う方式として、連続流動方式、液滴(液体プラグ)方式、駆動方式等、あるいは毛細管現象の利用を用いることが好ましい。
【0114】
毛細管力を働きやすくするため、流路を親水化処理して、濡れやすくすることが好ましい。親水化処理法として、従来の表面処理方法が適用できる。大きく分けて、化学的表面処理法と物理的表面処理法がある。化学的表面処理法としては、薬品処理、カップリング剤による処理、蒸気処理、グラフト化、電気化学的方法、添加剤による表面改質などがある。物理的表面処理法としては、UV照射、電子線処理、イオンビーム照射、低音プラズマ処理、CASING処理、グロー、コロナ放電処理、酸素プラズマなどの方法がある。
【0115】
本発明の一体化チップは、同じ検体は同時に2項目以上の分析が可能であることも特徴のひとつである。
同時に2項目以上の分析を可能にするために、前記前処理要素と複数の検出反応部を複数の流路でつなげる。
前記前処理要素と複数の検出反応部の間の複数流路の連結形態は、直接前処理要素から各検出反応部へ分岐してもよい。また、前処理要素から一部流路は共用し、各検出反応部の手前で分岐してもよい。検体液を同時に各反応部に供給するために、分岐流路の長さは同じにすることが好ましい。
【0116】
本発明の分析チップが対象とする被検物質は特に限定されず、任意の液体試料(例えば、全血、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、髄液、膣液などの体液;あるいは飲料水、酒類、河川水、工場廃水等)中の特定成分を分析することができる。例えば、アルブミン(ALB)、グルコース、尿素、ピリルビン、コレステロール、タンパク質、酵素(例えば、乳酸脱水素酵素、CPK(クレアチンキナーゼ)、ALT(アラニンアミノトランスフェラーゼ)、AST(アスパルテートアミノトランスフェラーゼ)、GGT(γ−グルタミルトランスペプチダーゼ)等の血中酵素)などを分析することができる。
【0117】
本発明の分析チップには、例えば0.1μl〜30μl、好ましくは1〜10μlの範囲の水性液体試料液を、点着する。点着した分析チップを約20℃〜約45℃の範囲の一定温度で、好ましくは約30℃〜約40℃の範囲内の一定温度で1〜10分間インキュベーションする。乾式多層分析要素内の発色又は変色を光透過性支持体側から反射測光し、予め作成した検量線を用いて比色測定法の原理により検体中の被験物質の量を求めることができる。
【0118】
測定操作は特開昭60−125543号公報、特開昭60−220862号公報、特開昭61−294367号公報、特開昭58−161867号公報(対応米国特許4,424,191)などに記載の化学分析装置により極めて容易な操作で高精度の定量分析を実施できる。なお、目的や必要精度によっては目視により発色の度合いを判定して、半定量的な測定を行ってもよい。
【0119】
本発明の分析チップは、分析を行うまでは乾燥状態で貯蔵・保管されるため、試薬を用時調製する必要がなく、また一般に乾燥状態の方が試薬の安定性が高いことから、試薬溶液を用時調製しなければならないいわゆる湿式法より簡便性、迅速性に優れている。また、微量の液体試料で、精度の高い検査を迅速に行うことができる検査方法としても優れている。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【0120】
実施例1:PDMS凹型作成
シリコンウエファー上に厚膜フォトレジストのSU−8をスピンコートして膜厚100μmとした。90℃で1時間予備加熱した後、図1に相応する流路パターン(1)を描いてあるマスクを通してUV光を照射し、90℃1時間で光照射部分を硬化させた。未硬化部分をプロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート(PGMEA)により溶解除去、水洗したのち乾燥し、シリコンウエファー/SU8凸型として使用した。
【0121】
この、シリコンウエファー凸型上に、PDMS(デュポンSylgard/硬化液=10/1 混合液)を流し込み、80℃で2時間硬化させた後シリコンウエファー凸型より静かに剥がしとり、図1に示すPDMS凹型パターン(1)を作成した。さらに、生研トレパン(カイインダストリー製)により、検体注入口1及び空気抜き2を(直径1mm)を、作成した(パターン(3))。
【0122】
次に、シリコンウエファー上に厚さ0.5mmのPETベースを瞬間接着剤ではりつけ図1に相応する流路パターン(2)の凸型を作成した。前述した方法で、PDMSを流しこみ、PDMS凹型パターン(2)を作成した。
【0123】
実施例2:α−アミラーゼ/抗HbA1CFab'の調整
(A)GMB化アミラーゼの調製
α−アミラーゼに以下のようにしてマレイミド基を導入した。5mg/mLの枯草菌α−アミラーゼ溶液(0.1 M グリセロリン酸緩衝,pH 7.0) の1mLに、GMBS( N-(γ-maleimidobutyryloxy)succinimide; 同仁化学製)の100mg/mL 溶液(DMF) 100μL を加えて、室温で1時間反応させた。この反応液をセファデックスG−25のカラムでゲル濾過にかけ、0.1 M グリセロ燐酸緩衝液(pH 7.0)で溶出し、素通り分画を分取、N-(γ-マレイミドブチリロキシ)アミド化アミラーゼ(GMB化アミラーゼ)を得た。得られたGMB化アミラーゼ溶液の濃度は1.35 mg/mLであった。
【0124】
(B)抗ヒトHbA1Cモノクローナル抗体の調製
ヒトHbA1Cに対するモノクローナル抗体IgGは、マウスに免疫して得られた免疫細胞(脾臓細胞)をマウスミエローマ細胞と融合し、クローニング後得られた抗体であり、常法により得たものである。すなわち、1mM KCN(pH7.45)に溶解した7μgの天然ヒトヘモグロビンA1Cと、143μLのRPMI−1640培地(1g/L 炭酸ナトリウム, 600mg/L L-グルタミン、 10mM HEPESを含有: pH6.8)及び200μLのフロイント完全アジュバントを混合し、これをマウスに皮下注射により免疫した。2週間ごとに追加免疫を行い、最後にマウス脾臓からBリンパ球を採取して、これをマウスミエローマ細胞と融合し、クローン化した。得られたクローンからヒトHbA1Cと特異的に反応し、他のヘモグロビン・サブクラスと実質的にまったく交差反応しない抗体を産生する細胞系を選別した。得られた抗体産生細胞を培養し、抗体精製によりヒトHbA1Cに対するモノクローナル特異抗体、すなわち抗ヒトHbA1c・マウスIgGを得た。
【0125】
(C)抗ヒトHbA1c・IgG Fab' の調製
得られた抗ヒトHbA1CマウスIgG 20mg を、10 mLの0.1 M 酢酸緩衝液(pH5.5) に溶解し、これに活性化パパイン600μgを加え37℃で2時間攪拌した。この反応液を、予め0.1 M 燐酸緩衝液(pH 6.0; 1 mM EDTA含有)で平衡化したスーパーデックス−200 ゲルカラムにアプライし、同燐酸緩衝液で溶出した。分子量10万付近に溶出したピーク部分を分取し、抗ヒトHbA1C・マウスIgG F(ab')2を得た。得られた抗ヒトHbA1C・IgG F(ab')2 10 mg を含む0.1 M 燐酸緩衝液(pH 6.0)2mLに、10 mg/mLの2−メルカプトエチルアミン塩酸塩水溶液を200μL加え、37℃で90分間攪拌した。この反応液を予め0.1 M 燐酸緩衝液(pH 6.0)で平衡化したセファデックスG−25でゲル濾過し素通り分画を分取して、抗ヒトHbA1C・IgG Fab'(以下単にFab'という)を得た。
【0126】
(D)α−アミラーゼ/Fab' 結合物の調製
上記(C)で得た抗HbA1C・IgG Fab'(Fab')の1.5 mg/mL 溶液6.5 mL に、(A)で調製したGMB化アミラーゼ2mgを加えて4℃で一晩反応させた。この反応液を、予め20 mM グリセロ燐酸(pH7.0; 10 mM CaCl2含有)で平衡化したスーパーデックス-200にゲル濾過して分子量30万以上の分画を集め、目的の酵素標識抗体(α−アミラーゼ/Fab'結合物)
【0127】
実施例3:HbA1C定量分析用乾式分析要素の作成
ゼラチン下塗層が設けられている厚さ180μmの無色透明ポリエチレンテレフタレート(PET)シート(支持体)上に下記の被覆量になるように架橋剤含有試薬溶液を塗布し、乾燥して試薬層を設けた。
【0128】
アルカリ処理ゼラチン 14.5 g/m
ノニルフェノキシポリエトキシエタノール 0.2 g/m
(オキシエチレン単位平均 9〜10含有)
グルコースオキシダーゼ 5000 IU/m
ペルオキシダーゼ 15000 IU/m
グルコアミラーゼ 5000 IU/m
2-(4-ヒドロキシ-3,5-ジメトキシフェニル-4-[4-(ジメチルアミノ)
フェニル]-5-フェネチルイミダゾール(ロイコ色素)酢酸塩 0.38 g/m
ビス[(ビニルスルホニルメチルカルボニル)アミノ]メタン 0.1 g/m
【0129】
この試薬層の上に下記の被覆量になるように接着層水溶液を塗布、これを乾燥して接着層を設けた。
アルカリ処理ゼラチン 14.5 g/m
ノニルフェノキシポリエトキシエタノール 0.2 g/m
(オキシエチレン単位平均 9〜10含有)
【0130】
次いで、接着層の表面に下記の被覆量になるように下記試薬含有水溶液を塗布し、ゼラチン層を膨潤させ、その上に50デニール相当のPET 紡績糸36ゲージ編みした厚さ約250 μmのトリコット編物布地をほぼ一様に軽く圧力をかけてラミネートして多孔性展開層(編物布地層)を設けた。
ノニルフェノキシポリエトキシエタノール 0.2 g/m
(オキシエチレン単位平均 9〜10含有)
ビス[(ビニルスルホニルメチル カルボニル)アミノ]メタン 0.1 g/m
【0131】
次に、展開層の上から下記の被覆量になるように基質含有水溶液を塗布し、これを乾燥することにより、多孔性展開層(編物布地層)を基質層とした。
メガファックF142D(大日本インキ製) 0.1 g/m
(フッ素界面活性剤)
(オキシエチレン単位平均10含有)
カルボキシメチル化澱粉 5 g/m
マンニトール 2 g/m
アミラーゼ阻害剤 100万 U/m
(富士レビオ製アミラーゼ阻害剤"I-1001C" :特開昭61-74587号公報)
【0132】
次ぎに、その基質層兼展開層に、さらに実施例2で調製した酵素標識抗体(α−アミラーゼ/Fab' 結合物)を3mg/mの被覆量となるようにしてエタノール溶液を塗布し含浸させ乾燥させて HbA1C分析用乾式多層分析スライド(1)を作成した。
【0133】
この乾式多層分析要素は、適当なサイズに裁断したのち、実施例(4)の一体型分析チップに使用した。
また、比較例として、この分析要素を15mm四方のチップに裁断し、特開昭57-63452に記載のスライドの枠に収めて、比較例のHbA1C定量分析スライド(比較例のスライド1)とした。
なおここで使用したアミラーゼ阻害剤"I-1001C"は、検体中に含まれることがある同種のアミラーゼに対する阻害剤であって、標識酵素として使用している枯草菌α−アミラーゼの酵素活性は阻害しないものである(特開平05-122112号公報参照)。
【0134】
実施例4:HbA1C定量用一体化分析チップの作成(図2)
実施例(3)で作成した、HbA1C測定用乾式分析要素を裁断後、実施例(1)で作成したPDMS凹型パターン(2)に組込んだ。このPDMS凹型と、実施例(1)で作成したPDMS凹型パターン(1)(注入口穴つき)を貼り付け一体型分析チップの大枠を作成した。
【0135】
次ぎに、注入口1より、前処理液(0.1%TritonX−100,2% 2−ブタノールを含有する10mMトリス塩酸緩衝液pH7.5溶液)5μlを静かに注入し、一体型分析チップとした。前処理要素と、分析要素をつなぐ流路は細くかつ疎水的なので溶血試薬は分析要素内には入り込まない。(図2参照)
【0136】
性能評価実験1:一体化分析チップによるHbA1Cの測定
(1)検量線の作成:
HbA1C溶液(13 mg/mL PBS; Exocell社製)20mMTris−HClpH7.5緩衝液で希釈して、HbA1C濃度1200 mg/dL〜75mg/dlの範囲で2倍づつ希釈した溶液を調製した。該希釈液0.2μlを注入口1より勢い良く注入し、前処理要素内の溶液を、分析要素上に供給し、37℃に保ちながら分光放射輝度計MCPD-2000(大塚電子株式会社)により650nmの反射濃度を測定し、2分後と10分後の反射ODの差(△OD2−10)を求めて検量線を作成した(図3)。
【0137】
(2)全血よりHbA1Cの測定:
人全血0.2μl(検体1)を注入口1より勢い良く注入し、前処理要素内の溶血液を、分析要素上に供給し、37℃に保ちながら分光放射輝度計MCPD-2000(大塚電子株式会社)により650nmの反射濃度を測定した、2分後と10分後の反射ODの差(△OD2−10)を求め、上記(1)で得られた検量線より、HbA1Cの濃度を算出したところ、720mg/dlであった。
【0138】
(3)上記(2)の実験を6回繰り返しその再現性をもとめたところCVは3.5%であった。
【0139】
性能評価実験2:乾式多層分析要素によるHbA1Cの測定(比較例)
(1)検量線の作成:
実施例(3)の乾式多層分析要素を15mm四方のチップに裁断し、特開昭57-63452号公報に記載のスライドの枠に収めて、比較例のHbA1C定量分析スライド(比較例のスライド1)とした。性能評価実験1の(1)と同様に、HbA1C溶液(13 mg/mL PBS; Exocell社製)20mMTris−HClpH7.5緩衝液で希釈して、HbA1C濃度1200 mg/dL〜75mg/dlの範囲で2倍づつ希釈した溶液を調製した。この希釈液0.4μlを10μlの0.1%TritonX−100、2% 2−ブタノールを含有する10mMトリス塩酸緩衝液pH7.5溶液と混合したのち、全量を比較例のスライド1に点着したのち、点着から2分後および10分後の反射光学濃度の差(ΔOD2−10 )を求めて、検量線を作成した。
【0140】
(2)全血よりHbA1Cの測定:
さらに、性能評価実験1で使用したものと同じ全血0.4μl(検体1:性能評価実験1と同じ)を10μlの0.1%TritonX−100、2%2−ブタノールを含有する10mMトリス塩酸緩衝液pH7.5溶液と混合したのち、全量を比較例のスライド1に点着したのち、点着から2分後および10分後の反射光学濃度の差(ΔOD2−10 )を求め、上記(1)で得られた検量線よりHbA1Cの濃度を算出したところ715 mg/dlであった。
【0141】
(3)上記(2)の実験を6回繰り返しその再現性をもとめたところ CVは4.5%であった。
【0142】
(性能評価実験1及び2の比較)
上記した性能評価実験1の結果より明らかなように、本発明の一体型分析要素は、実質的な前処理をすることなく、HbA1Cの測定が可能である。また、上記した性能評価実験1及び2の結果の比較から明らかなように、本発明の一体型分析要素を用いた場合は、同時再現性も良好であり、本発明の一体型分析チップの性能が良好であることが実証された。
【0143】
実施例5:混合手段を含むHbA1C定量用一体化分析チップの作成(図4)
実施例(1)の方法で図4に示すPDMS凹型パターン(1)と(2)を作成した。実施例(3)で作成したHbA1C測定用乾式分析要素をΦ5mmに加工後、作成したPDMS凹型パターン(2)の22と23に組込んだ。また、微小攪拌子を同じPDMS凹型パターン(2)の21に組み込んだ。このPDMS凹型と、作成したPDMS凹型パターン(1)(注入口穴つき)を貼り付け一体型分析チップの大枠を作成した(図5)。
【0144】
性能評価実験3:混合手段の含んだ一体化分析チップによるHbA1Cの測定(本発明の測定例)
【0145】
(1)全血よりHbA1Cの測定:
空気口12,13同時に閉じる状態下で、人全血0.2μlを注入口より前処理要素内に注入し、前処理要素内には前処理液(0.1%TritonX−100,2% 2−ブタノールを含有する10mMトリス塩酸緩衝液pH7.5溶液)10μlを含有している。磁気攪拌子で血液と溶血剤液を均一させる。その後、空気口12,13同時に開け、処理後検体液は毛細管力で迅速同時に分析要素上に供給し、37℃に保ちながら分光放射輝度計MCPD-2000(大塚電子株式会社)により650nmの反射濃度を測定し、HbA1Cの濃度を算出した。725mg/dlであった。同時に420nmの反射濃度を測定し、Hbの濃度を算出した。13.2g/dlであった。HbA1CとHbが同時検出できた。
【0146】
上記(1)の実験を6回繰り返しその再現性をもとめたところ CVは3.2%であった。
【0147】
(性能評価実験3及び2の比較)
上記した性能評価実験3の結果より明らかなように、本発明の攪拌手段が含んだ一体型分析要素は、実質的な前処理をすることなく、HbとHbA1Cの同時測定が可能である。また、上記した性能評価実験3及び2の結果の比較から明らかなように、本発明の一体型分析要素を用いた場合は、同時再現性も良好であり、本発明の一体型分析チップの性能が良好であることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【0148】
【図1】図1は、流路パターンを示す。
【図2】図2は、一体化分析チップを示す。
【図3】図3は、一体化分析チップによるHbA1Cの測定のために作成した検量線を示す。
【図4】図4は、本発明の流路パターンを示す。
【図5】図5は、本発明の一体化分析チップを示す。




 

 


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