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AMPK活性化剤 - 花王株式会社
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発明の名称 AMPK活性化剤
発行国 日本国特許庁(JP)
公報種別 公開特許公報(A)
公開番号 特開2007−63241(P2007−63241A)
公開日 平成19年3月15日(2007.3.15)
出願番号 特願2005−257047(P2005−257047)
出願日 平成17年9月5日(2005.9.5)
代理人 【識別番号】110000084
【氏名又は名称】特許業務法人アルガ特許事務所
発明者 村瀬 孝利
要約 課題
食経験が豊富で安全性が高く、入手が容易で加工性にも優れたAMPK活性化剤、肥満抑制剤等の提供。

解決手段
ヌートカトン又はその誘導体を有効成分とするAMPK活性化剤、脂質代謝活性化剤、肥満抑制剤、糖尿病抑制剤、動脈硬化抑制剤、高脂血症抑制剤、運動代替剤。
特許請求の範囲
【請求項1】
ヌートカトンを有効成分とするAMPK活性化剤。
【請求項2】
ヌートカトンを有効成分とする脂質代謝活性化剤。
【請求項3】
ヌートカトンを有効成分とする肥満抑制剤。
【請求項4】
ヌートカトンを有効成分とする糖尿病抑制剤。
【請求項5】
ヌートカトンを有効成分とする動脈硬化抑制剤。
【請求項6】
ヌートカトンを有効成分とする高脂血症抑制剤。
【請求項7】
ヌートカトンを有効成分とする運動代替剤。
【請求項8】
ヌートカトンを含有し、生活習慣病抑制作用を有することを特徴とし、そのために用いる旨の表示を付した飲食品。
【請求項9】
生活習慣病が肥満、高脂血症、糖尿病及び動脈硬化症から選ばれるものである請求項8記載の飲食品。
【請求項10】
ヌートカトンを含有し、脂質代謝促進作用を有することを特徴とし、そのために用いる旨の表示を付した飲食品。
【請求項11】
ヌートカトンを含有し、運動代替機能を有することを特徴とし、その旨の表示を付した飲食品。
発明の詳細な説明
【技術分野】
【0001】
本発明は、肥満、糖尿病、動脈硬化症等の生活習慣病の抑制に有用なAMPK(AMP-activated protein kinase)活性化剤に関する。
【背景技術】
【0002】
近年、肥満人口が増大し、それに伴って糖尿病等のいわゆる生活習慣病が大きな社会問題となっている。肥満は、摂取エネルギー量が消費エネルギー量を上回り、エネルギー過剰となることにより生じる。したがって、肥満やそれに伴って発症する糖尿病の予防・改善は、例えば、食事量を減らすこと等により摂取エネルギー量を減らすこと、又は運動を行うこと等により消費エネルギー量を増やすことが基本となる。
【0003】
しかし、現代社会においては、食生活の欧米化により脂質摂取量が増えると同時に、自動車の普及等により運動量が減少しエネルギー消費量が低下し、その結果として肥満人口が増大し、それに伴って糖尿病等のいわゆる生活習慣病の増加が大きな社会問題となっている。運動はエネルギー代謝を促進することにより、肥満や糖尿病をはじめとする各種の生活習慣病の予防・改善に有効であることは広く認識されているが、実生活において日常的に運動を行うことは、なかなか容易なことではない。従って、運動以外の何らかの方法により、運動によりもたらされるのと同様の効果をもたらすことや、限られた運動であってもその作用をより有効に引き出すことができれば有用である。すなわち、運動しなくとも運動したのと類似の効果を発揮する運動代替手段の開発が望まれている。
【0004】
これまでに肥満を予防・改善する物質として、例えば、大豆エキス(特許文献1)、シアニジン 3−グルコシド(特許文献2)、サトウキビポリフェノール(特許文献3)、D−システノール酸(特許文献4)、共役トリエン酸系油脂(特許文献5)等多くの化合物やエキス類が見出されてきた。しかしながら、これらの多くは肥満改善における作用機構が明らかにされておらず、また、食経験に乏しいことから安全性の確認が十分になされておらず、その有用性は十分明確にされていないのが実情である。
【0005】
一方、エネルギー代謝や肥満、糖尿病発症機構に関する研究が進み、AMPKがきわめて重要な働きをしていることが明らかになってきた(非特許文献1)。AMPK(AMP−activated protein kinase)は、筋肉や肝臓など生体に広く存在するタンパク質であり、細胞内ATPレベルが低下するような状況下において活性が上昇することにより、代謝を促進してATP合成を促すタンパク質("metabolic sensor")であることが知られている。すなわち、AMPKは、活性化によりエネルギー消費を促進することが知られている。ところが最近の研究によって、AMPKが単に細胞内のエネルギーレベルにより調節されるだけではなく、筋肉運動、レプチン(非特許文献2)、アディポネクチンのような脂肪細胞由来ホルモン(非特許文献3)、糖尿病治療薬であるメトフォルミン(非特許文献4)等によっても活性化され、それらによって惹起される脂肪酸酸化やグルコース利用促進作用の細胞内メディエーターであると考えられるようになってきた。例えば、AMPKは、長鎖脂肪酸をミトコンドリア内に取り込むカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ(CPT−1)をアセチルCoAカルボキシラーゼ(ACC)の活性制御を通して活性化することにより、脂肪酸酸化を促進することが知られている。すなわち、CPT−1は、ACCの産物であるマロニルCoAによって強く阻害されるが、AMPKは、当該ACCのSer79をリン酸化することにより、ACCの活性を抑制していると考えられている。このことから、AMPKを活性化するような薬剤は、脂肪酸酸化を促し、またエネルギー消費量を増大させ、肥満や糖尿病をはじめとする生活習慣病の予防及び治療や、運動と類似の効果を発揮することにより運動不足の解消に有用であると考えられている。
【0006】
従来AMPKを活性化する化合物としては、上記のレプチン、アディポネクチンやメトフォルミンの他、AICAR(5−アミノイミダゾール−4−カルボキサミド)が知られているが、食経験が豊富で安全性が高く、入手が容易で加工性にも優れた素材は現時点においては殆どなかった。
【0007】
ヌートカトンは、4,4a,5,6,7,8−ヘキサヒドロ−6−イソプロペニル−4,4a−ジメチル−2(3H)−ナフタレノンなるセスキテルペンケトンであり、グレープフルーツ果皮等に存在し、グレープフルーツの特徴的な香味を有するため香料としては非常に注目されている物質であるが(非特許文献5)、これまでその生理作用についてはほとんど報告されていない。また、グレープフルーツに関しては、グレープフルーツオイル(精油)を含有する香料組成物が、交感神経系を活性化することにより、抗肥満作用を示すこと(特許文献6)、グレープフルーツオイルを含有する皮膚外用剤(特許文献7)が報告されているが、ヌートカトンが抗肥満作用を有することについては全く知られていない。
【特許文献1】特開2003−286180号公報
【特許文献2】特開2003−252766号公報
【特許文献3】特開2003−137803号公報
【特許文献4】特開2003−104879号公報
【特許文献5】特開2002−186424号公報
【特許文献6】特開2002−193824号公報
【特許文献7】特開2005−47935号公報
【非特許文献1】Molecular Medicine,Vol.39,No.4,p.398-407、2002
【非特許文献2】Nature,Vol.415,p.339-343,2002
【非特許文献3】Nature,Vol.423,p.762-769,2003
【非特許文献4】J.Clin.Invest.,Vol.108,p.1167-1174,2001
【非特許文献5】荒井綜一編、「最新 香料の事典」、第1版、朝倉書店、2000年5月10日、p.112、p.254
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の目的は、食経験が豊富で安全性が高く、入手が容易で加工性にも優れたAMPK活性化剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、食経験が豊富な天然物素材を探索したところ、ヌートカトンにAMPK活性化作用があり、これを摂取することにより、肥満、高脂血症、糖尿病、動脈硬化症等の生活習慣病の予防、治療及び改善や運動不足の解消に有用であることを見出した。
【0010】
すなわち本発明は、ヌートカトンを有効成分とするAMPK活性化剤を提供するものである。
【0011】
また本発明は、ヌートカトンを有効成分とする脂質代謝活性化剤を提供するものである。
【0012】
また本発明は、ヌートカトンを有効成分とする肥満抑制剤を提供するものである。
【0013】
また本発明は、ヌートカトンを有効成分とする糖尿病抑制剤を提供するものである。
【0014】
また本発明は、ヌートカトンを有効成分とする動脈硬化抑制剤を提供するものである。
【0015】
また本発明は、ヌートカトンを有効成分とする高脂血症抑制剤を提供するものである。
【0016】
また本発明は、ヌートカトンを有効成分とする運動代替剤を提供するものである。
【0017】
また本発明は、ヌートカトンを含有し、生活習慣病抑制作用を有することを特徴とし、そのために用いる旨の表示を付した飲食品を提供するものである。
【0018】
また本発明は、ヌートカトンを含有し、脂質代謝促進作用を有することを特徴とし、そのために用いる旨の表示を付した飲食品を提供するものである。
【0019】
また本発明は、ヌートカトンを含有し、運動代替機能を有することを特徴とし、その旨の表示を付した飲食品を提供するものである。
【発明の効果】
【0020】
本発明のAMPK活性化剤、脂質代謝活性化剤、肥満抑制剤、糖尿病抑制剤、動脈硬化抑制剤、高脂血症抑制剤及び運動代替剤は、脂質代謝や糖代謝等のエネルギー代謝の活性化を誘導し、安全性に優れることから、肥満、高脂血症、糖尿病及び動脈硬化症等の生活習慣病の予防、治療及び/又は改善や、運動と類似の効果を発揮し、運動不足の解消に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0021】
本発明において、ヌートカトンとは、4,4a,5,6,7,8−ヘキサヒドロ−6−イソプロペニル−4,4a−ジメチル−2(3H)−ナフタレノンなるセスキテルペンケトンをいう。当該ヌートカトンには、8種類の光学異性体が存在する。本発明のAMPK活性化剤においては、それら異性体を単独又は混同して用いることができるが、次の構造式(I)で表される(+)−ヌートカトンを用いるのが好ましい。
【0022】
【化1】


【0023】
本発明で用いるヌートカトンは、公知の有機化学的合成、微生物を用いた合成等により製造することができ、例えば、特開2004−123561公報、特開2003−250591公報、特表平11−501052公報に記載の方法により得ることができる。
【0024】
また、本発明で用いるヌートカトンは、ヌートカトンを含有する天然物から公知の方法により抽出することにより得ることもできる。ここで、抽出は、例えば、水、熱水、アルコール水、有機溶剤等を用いて行う抽出操作と高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等による精製操作や蒸留操作を適宜組み合わせて行う方法により行うことができる。ヌートカトンを含有する天然物としては、例えばグレープフルーツが挙げられる。グレープフルーツから抽出する場合、その原料としては例えば、グレープフルーツ果実、グレープフルーツ果皮、グレープフルーツオイル、グレープフルーツ濃縮果汁、グレープフルーツ果汁搾汁後の残渣等を用いることができる。
【0025】
上記合成や抽出により得られるヌートカトンは、単数又は複数工程の精製等により夾雑物が除かれた高純度のものを用いることが好ましいが、本発明の効果を奏する限り粗精製物であってもよい。
【0026】
本発明のヌートカトンは、後記実施例に示すとおり、筋細胞において強いAMPK活性化作用を有するため、AMPK活性化剤として用いることができる。AMPK活性化は、脂質酸化を促進し、エネルギー消費の促進をもたらす。また、AMPK活性化により、グルコース輸送体(GLUT)を介したグルコース取り込みが増加し、グルコースの利用を促進する。従って、ヌートカトンは、AMPK活性化剤、脂質代謝活性化剤、肥満抑制剤、糖尿病抑制剤、動脈硬化抑制剤及び高脂血症抑制剤として、肥満、高脂血症、糖尿病、動脈硬化症等の生活習慣病の予防、治療及び/又は改善に有用である。また、ヌートカトンは、前記の運動不足が原因の一つとなっている種々の症状を改善することから、運動と類似の効果をもたらす運動代替剤、特に肥満、体脂肪蓄積、糖尿病、脂肪肝、生活習慣病などの予防改善を目的とする運動代替剤として有用である。当該AMPK活性化剤等は、ヒト及び動物に投与することができる他、各種飲食品、医薬品、ペットフード等に配合して摂取することができる。飲食品とする場合には、一般の飲食品の他、肥満、高脂血症、糖尿病、動脈硬化症等の生活習慣病の予防及び/又は改善、高血糖、インスリン抵抗性、脂質代謝促進等の生理機能をコンセプトとする機能性飲食品、病者用食品、特定保健用食品に応用できる。医薬品として使用する場合は、例えば、錠剤、顆粒剤等の経口用固形製剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤とすることができる。
【0027】
尚、経口用固形製剤を調製する場合には、本発明のヌートカトンに賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。また、経口用液体製剤を調製する場合は、矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯味剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。
【0028】
飲食品、医薬品、ペットフード等に対するヌートカトンの配合量は、その使用形態により異なるが、飲食品やペットフード等として用いる場合には、通常0.0002〜5質量%、更に0.001〜3質量%、特に0.02〜2質量%とするのが好ましい。医薬品、例えば錠剤、顆粒剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤等として用いる場合には、通常0.01〜95質量%、更に0.1〜95質量%、特に2〜80質量%とするのが好ましい。
【0029】
本発明のAMPK活性化剤、脂質代謝活性化剤、肥満抑制剤、糖尿病抑制剤、動脈硬化症抑制剤、高脂血症抑制剤及び運動代替剤の投与量(有効摂取量)は、ヌートカトンとして、一日当り1〜2000mg/60kg体重とするのが好ましく、特に2〜1000mg/60kg体重、更に5〜500mg/60kg体重とするのが好ましい。
【実施例】
【0030】
実施例1
ヌートカトンのAMPK活性化作用を、筋細胞株(C2C12)を用い、AMPKα及びβのリン酸化を指標として、次法により評価した。
【0031】
マウス筋細胞株(C2C12)を25cm2フラスコにまき、DMEM(+10%FBS、+抗菌剤)中37℃で1〜2日培養した。コンフルエントになった時点で培養液を除去し、PBS(−)で洗浄後、DMEM(2%(V/V)Horse serum)に置き換え、2〜3日毎に培養液を交換しながら更に7〜8日培養した。その後培養液を除去し、PBS(−)で洗浄後、DMEM(−FBS)に置き換え、更に1日培養した。培養液を除去後、所定濃度のヌートカトン(和光純薬社製)を含むDMEM(−FBS)を加え、60分間培養した。次いで培養液を除去、PBS(−)で洗浄後、細胞溶解液(10mmol/L Tris(pH7.4)、50mmol/L塩化ナトリウム、30mmol/Lピロリン酸ナトリウム、0.5%(V/V)Triton X−100、protease inhibitor cocktail(SIGMA P2714)、phosphatase inhibitor cocktail−1(SIGMA P2850)、phosphatase inhibitor cocktail−2(SIGMA P5726))を200μL添加し、セルスクレイパーで細胞溶解液を回収した。回収した細胞溶解液は、23Gの針付シリンジを3回通すことにより良くホモジナイズし、その後30分間氷上に放置した。15000r/minで15分間、4℃で遠心した後、その上清蛋白を以下の測定に用いた。
【0032】
上清蛋白質の濃度を測定後、サンプル間の蛋白濃度を一定に調整した。その四分の一量のSDSバッファー(250mmol/L Tris、12.5質量%SDS、20質量%グリセリン)を加えた後、更に2−メルカプトエタノール及びブロモフェノールブルーを加え、95℃で熱変性、4℃で急冷し、電気泳動用のサンプルを調製した。
【0033】
上記泳動用サンプルを、一定量(約20〜40μg)をSDS−PAGE(12%ゲル)に供し、膜へ転写後、anti−phospho−AMPKα(Thr72)抗体(Cell Signaling社製)又はanti−phospho−AMPKβ(Ser108)抗体gnaling社製)を一次抗体、anti−rabbit−HRP抗体(アマシャム社(Cell Signaling社製)を一次抗体、anti−rabbit−HRP抗体(アマシャム社製)を二次抗体、phototope−HRP Western Detection System(Cell Signaling社製)を検出試薬として用いて、phospho−AMPKαおよびphospho−AMPKβを検出した。AMPK活性化の度合いは、検出されたバンドの強度を画像解析(EDAS290画像解析システム:KODAK)により数値(ピクセル)化し、コントロール(サンプル無添加群)を100とし、それに対する相対値として示した。
【0034】
【表1】


【0035】
表1からヌートカトンは、筋細胞において強いAMPK活性化作用を有することがわかる。
【0036】
実施例2 ヌートカトンの効果
ヌートカトンの抗肥満・抗糖尿病・抗生活習慣病効果を下記のように評価した。
7週齢のC57BL/6系雄性マウスを各群10匹ずつ3群に分け、表2記載の組成の各食餌で飼育した。
【0037】
【表2】


【0038】
22週後体重を測定するとともに、エーテル麻酔下で非絶食条件下、採血を行い血清グルコース、コレステロール、トリグリセリド、インスリン、レプチン値を測定した。また、内臓脂肪量(副睾丸脂肪、後腹膜脂肪および腎周囲脂肪)を測定した。結果を表3に示す。
【0039】
【表3】


【0040】
第2群では第1群に比し、顕著な体重の上昇及び内臓脂肪量増加が認められたのに対して、第3群では第2群に比し、体重増加量及び全内臓脂肪量は顕著に低下した。すなわち、本発明のヌートカトンは優れた抗肥満効果を有していることが明らかとなった。血液分析の結果を表4に示す。
【0041】
【表4】


【0042】
第2群では第1群に比較し、顕著な血糖値(グルコース)の上昇が認められたのに対して、第3群においては第1群に対しての血糖値上昇は認められず、また第2群に対しても血糖値は低値を示した。本発明のヌートカトンは、血糖値上昇抑制効果に優れ、糖尿病の抑制に有効であると考えられた。
【0043】
第2群では第1群に比較し、顕著なコレステロール値の上昇が認められたのに対して、第3群においては第1群に対してのコレステロール値の上昇は少なく、また第2群に対してコレステロール値は低値を示した。本発明のヌートカトンは、血中コレステロール値上昇抑制に優れ、動脈硬化の抑制に有効であると考えられた。
【0044】
第2群では第1群に比較し、顕著なトリグリセリド値の上昇が認められたのに対して、第3群においては第1群に対してのトリグリセリド値の上昇は少なく、また第2群に対してトリグリセリド値は低値を示した。本発明のヌートカトンは、血中トリグリセリド値上昇抑制に優れ、高脂血症の抑制に有効であると考えられた。
【0045】
第2群では第1群に比較し、顕著なインスリン値の上昇が認められたのに対して、第3群においては第1群に対してのインスリン値の上昇は少なく、また第2群に対してインスリン値は低値を示した。本発明のヌートカトンは、血中インスリン値上昇抑制に優れ、高インスリン血症の抑制に有効であると考えられた。また、本結果は、ヌートカトンがインスリン抵抗性を伴う2型糖尿病の発症を抑制していることを示している。
【0046】
第2群では第1群に比較し、顕著なレプチン値の上昇が認められたのに対して、第3群においては第1群に対してのレプチン値の上昇は少なく、また第2群に対してレプチン値は低値を示した。本発明のヌートカトンは、血中レプチン値上昇抑制に優れ、高レプチン血症の抑制に有効であると考えられた。
【0047】
実施例3 脂質代謝活性化効果
7週齢のBalb/c系雄性マウスを2群に分け、生理食塩水(コントロール)または200mg/kg体重となるようヌートカトンを10日間、連続して経口投与した。その後、肝臓及び骨格筋(腓腹筋+ひらめ筋)を採取した。肝臓及び骨格筋はそれぞれ緩衝液(250 mM sucrose,1 mM EDTA in10 mM HEPES (pH 7.2))中でホモジナイズし、不溶性の組織残渣を遠心分離し上清を得た。得られた上清について蛋白量の測定を行い、各サンプル間の蛋白量を一定に合わせ、脂質代謝活性(β酸化活性)の測定に用いた。100μgの上清タンパク質を、終容量200μLの緩衝液(50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 40 mM NaCl, 2 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5 mM ATP, 0.2 mM L-carnitine, 0.2 mM NAD, 0.06 mM FAD, 0.12 mM CoA, 3 mM α-cyclodextrin)中、0.1μCi[14C]−パルミチン酸と37℃で20分間反応させた。200μLの0.6N perchloric acidで反応を停止後、1mLのヘキサンで3回、未反応の[14C]−パルミチン酸を除去し、水層の放射活性を測定することにより、脂質分解活性を評価した。
測定結果を表5に示す。コントロールの脂質分解活性を100とし、その相対値で表示した。ヌートカトンを摂取することにより、肝臓及び骨格筋の脂質分解活性(β酸化活性)が顕著に増加した。したがって、ヌートカトンは脂質代謝の活性化に有効であることが明らかとなった。また、AMPK活性化作用を介して前記運動不足が原因の一つとなっている種々の症状を改善することから、運動と類似の効果をもたらす運動代替剤、特に肥満、体脂肪蓄積、糖尿病、脂肪肝、生活習慣病などの予防改善を目的とする運動代替剤として有用であることが明らかとなった。
【0048】
【表5】


【0049】
実施例4 製剤例
下記(1)〜(7)の各種製剤を製造した。
(1)生活習慣病予防・改善用カプセル剤
カプセル化剤中に下記組成物(300mg)を封入した。
【0050】
【表6】


【0051】
(2)生活習慣病予防・改善用錠剤
下記組成物(1錠=250mg)を打錠し、錠剤を製造した。
【0052】
【表7】


【0053】
(3)生活習慣病予防・改善用顆粒剤
下記組成物(1袋=500mg)を混合し顆粒剤を製造した。
【0054】
【表8】


【0055】
(4)肥満、生活習慣病予防・改善用飲料
下記組成物を混合し、果汁飲料を製造した。
【0056】
【表9】


【0057】
(5)肥満、生活習慣病予防・改善用飲料
下記組成物を混合し、果汁飲料を製造した。
【0058】
【表10】


【0059】
(6)肥満、生活習慣病予防・改善用飲料
下記組成物を混合し、茶飲料を製造した。
【0060】
【表11】


【0061】
(7)肥満、生活習慣病予防・改善用飲料
下記組成物を混合し、スポーツタイプ飲料を製造した。
【0062】
【表12】


【0063】
(8)運動代替機能性飲料
下記組成の炭酸飲料を製造した。
【0064】
【表13】


【0065】
(9)運動代替機能性飲料
下記組成の炭酸飲料を製造した。
【0066】
【表14】


【0067】
(10)運動代替機能性食品
下記組成物(1錠=1000mg)を打錠し、チュアブルタイプのタブレット食品を製造した。
【0068】
【表15】


【0069】
(11)運動代替機能性飲料
下記組成の炭酸飲料を製造した。
【0070】
【表16】


【0071】
(12)肥満、生活習慣病予防・改善用飲料
下記組成物を混合し、飲料を製造した。
【0072】
【表17】


【0073】
(13)肥満、生活習慣病予防・改善用飲料
下記組成物を混合し、果汁飲料を製造した。
【0074】
【表18】


【0075】
(14)生活習慣病予防・改善用錠剤
下記組成物(1錠=250mg)を打錠し、錠剤を製造した。
【0076】
【表19】






 

 


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