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発明の名称 腹腔内の脂肪組織量を推定するための分析方法
発行国 日本国特許庁(JP)
公報種別 公開特許公報(A)
公開番号 特開2001−8699(P2001−8699A)
公開日 平成13年1月16日(2001.1.16)
出願番号 特願平11−185737
出願日 平成11年6月30日(1999.6.30)
代理人 【識別番号】100093285
【弁理士】
【氏名又は名称】久保山 隆 (外2名)
【テーマコード(参考)】
2G045
4B024
4B063
【Fターム(参考)】
2G045 AA25 AA35 CB01 CB26 DA12 DA13 DA14 FB01 FB02 GC30 JA01 
4B024 AA11 CA09 CA12 HA12
4B063 QA01 QA18 QA19 QQ02 QQ53 QR08 QR55 QR62 QS25 QS34 QX01 QX07
発明者 松澤 佑次 / 村上 裕子 / 松木 泰 / 西澤 雅子
要約 目的


構成
特許請求の範囲
【請求項1】下記(a)〜(f)から選ばれる1以上の遺伝子転写物の腹腔内脂肪組織における発現レベルを指標として、該発現レベルと腹腔内の脂肪組織量とを関連づけることを特徴とする腹腔内脂肪組織量の推定方法。
(a)配列番号10で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子転写物(b)配列番号1で示される塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし得る遺伝子転写物(c)配列番号11で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子転写物(d)配列番号2で示される塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし得る遺伝子転写物(e)配列番号12で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子転写物(f)配列番号3で示される塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし得る遺伝子転写物【請求項2】(a)〜(f)から選ばれる1以上の遺伝子転写物の腹腔内脂肪組織における発現レベルと、腹部臍位横断面の腹腔内脂肪組織面積値との相関関係に基づき、前記発現レベルと腹腔内の脂肪組織量とを関連づける請求項1記載の腹腔内脂肪組織量の推定方法。
【請求項3】腹腔内の脂肪組織量を推定するための分析方法であって、下記(a)〜(f)から選ばれる1以上の遺伝子転写物の腹腔内脂肪組織における発現レベルと、腹部臍位横断面の腹腔内脂肪組織面積値との相関関係に基き、被験動物由来の腹腔内脂肪組織試料における前記遺伝子転写物の発現レベルから該動物の前記面積値を求める工程を含む方法。
(a)配列番号10で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子転写物(b)配列番号1でで示される塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし得る遺伝子転写物(c)配列番号11で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子転写物(d)配列番号2で示される塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし得る遺伝子転写物(e)配列番号12で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子転写物(f)配列番号3で示される塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし得る遺伝子転写物【請求項4】(a)〜(f)から選ばれる1以上の遺伝子転写物の腹腔内脂肪組織における発現レベルと、腹部臍位横断面の腹腔内脂肪組織面積値とから求められた相関関係式に、被験動物由来の腹腔内脂肪組織試料における前記遺伝子転写物の発現レベルを代入して演算することにより該動物の前記面積値を求める請求項3記載の方法。
【請求項5】下記(a)〜(f)から選ばれる1以上の遺伝子転写物の腹腔内脂肪組織における発現レベルを指標として、被験動物から経時的に採取された腹腔内脂肪組織試料における前記遺伝子転写物の発現レベルの増加度または減少度に基づき、該被験動物の腹腔内の脂肪組織量の経時的な増加度または減少度を推定する腹腔内脂肪組織量の増減の推定方法。
(a)配列番号10で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子転写物(b)配列番号1で示される塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし得る遺伝子転写物(c)配列番号11で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子転写物(d)配列番号2で示される塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし得る遺伝子転写物(e)配列番号12で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子転写物(f)配列番号3で示される塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし得る遺伝子転写物【請求項6】(a)〜(f)から選ばれる1以上の遺伝子転写物の腹腔内脂肪組織における発現レベルが、ノサ゛ンハイフ゛リタ゛イセ゛ーション法、RT-PCR法またはin situ ハイフ゛リタ゛イセ゛ーション法で測定された値である請求項1〜5記載の方法。
発明の詳細な説明
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、腹腔内の脂肪組織量を推測するための分析方法に関する。
【0002】
【従来の技術】近年、腹腔内の脂肪組織、とりわけ腸間膜脂肪や大網脂肪など門脈に流入する血管の周囲に存在する脂肪組織への脂肪の蓄積による該組織量の増大が、糖尿病、高脂血症、動脈硬化などの代謝性疾患や狭心症、心筋梗塞、高血圧などの循環器疾患の病態形成と密接に関連することが明らかにされた(Geriatric Medicine,vol.30, p.11, 1992, Am.J. Cardiol. ,vol.64, p.369, 1989)。そこで、このような疾患の発症リスクを予測するために、腹腔内の脂肪組織量を推定するための方法の開発が求められている。腹腔内の脂肪組織量を推定する方法としては、コンピューター断層撮影(computed tomography)法(Int. J. Obes.,vol 7,p.437, 1983)や、超音波検査法、磁気共鳴映像法(MRI)(症状から見た画像診断;日本医師会編)等により腹部臍位横断面の脂肪組織面積を測定する方法が報告されている。これらの方法は、腹部臍位横断面の脂肪組織面積値と腹腔内の脂肪組織の総量との間に相関性があり、前記脂肪組織面積値から腹腔内の脂肪組織の総量を推定することができるとの知見(Int. J. Obesity, vol.17, p.187, 1993)に基づく方法である。これらの方法は、高価な装置を必要とし検査費用もかさむため、手軽に利用できるとは言い難い。また、上記のような装置を用いることなく腹腔内の脂肪組織量を推定する方法としては、ウエストとヒップの周径比(W/H比)を指標とする方法(J. Clin. Endocrinol. Metab., vol.54, p.254, 1982)が報告されているが、W/H比は腹部全体の脂肪量をおおまかに示す値であって皮下脂肪組織量と腹腔内脂肪組織量とを明確には区別できず、よって、W/H比を指標として腹腔内の脂肪組織量を推定する方法は、精度の点で必ずしも満足できるとは言い難い。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】そこで、腹腔内の脂肪組織量を推定するための分析方法として、高価な特別の装置を必要とせず、また、皮下脂肪組織量とは係りなく腹腔内脂肪組織量を推定することのできる方法の開発が切望されている。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる状況の下、鋭意検討した結果、ある特定の遺伝子転写物の腹腔内脂肪組織における発現レベルが、腹部臍位横断面の腹腔内脂肪組織面積値と正の相関関係にあり、腹腔内の脂肪組織量の指標として有用であることを見出し、本発明に至った。すなわち、本発明は、1)下記(a)〜(f)から選ばれる1以上の遺伝子転写物の腹腔内脂肪組織における発現レベルを指標として、該発現レベルと腹腔内の脂肪組織量とを関連づけることを特徴とする腹腔内脂肪組織量の推定方法(a)配列番号10で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子転写物(b)配列番号1で示される塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし得る遺伝子転写物(c)配列番号11で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子転写物(d)配列番号2で示される塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし得る遺伝子転写物(e)配列番号12で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子転写物(f)配列番号3で示される塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし得る遺伝子転写物2)腹腔内の脂肪組織量を推定するための分析方法であって、前項1)記載の(a)〜(f)から選ばれる1以上の遺伝子転写物の腹腔内脂肪組織における発現レベルと、腹部臍位横断面の腹腔内脂肪組織面積値との相関関係に基き、被験動物由来の腹腔内脂肪組織試料における前記遺伝子転写物の発現レベルから該動物の前記面積値を求める工程を含む方法3)前項1)記載の(a)〜(f)から選ばれる1以上の遺伝子転写物の腹腔内脂肪組織における発現レベルを指標として、被験動物から経時的に採取された腹腔内脂肪組織試料における前記遺伝子転写物の発現レベルの増加度または減少度に基づき、該被験動物の腹腔内の脂肪組織量の経時的な増加度または減少度を推定する腹腔内脂肪組織量の増減の推定方法を提供するものである。
【0005】
【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。本発明において、「腹腔内の脂肪組織量」とは、腹腔内の腹直筋、外内腹斜筋、腹横筋、腰方形筋、大腰筋および錐体の内側に存在する脂肪組織の総量を意味する。また、「腹部臍位横断面の腹腔内脂肪組織面積」とは、 コンピューター断層撮影(computed tomography)法(Int. J. Obes., vol 7,p.437, 1983)、超音波検査法、磁気共鳴映像法(MRI)(症状から見た画像診断;日本医師会編)などに代表される方法により得られる腹部臍位横断面撮影像において、腹腔内すなわち腹直筋、外内腹斜筋、腹横筋、腰方形筋、大腰筋および錐体の内側にみられる脂肪組織が占める面積を指す。
【0006】本発明において、腹腔内の脂肪組織量の指標とすることのできる遺伝子転写物は、(a)配列番号10で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子転写物(b)配列番号1で示される塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし得る遺伝子転写物(c)配列番号11で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子転写物(d)配列番号2で示される塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし得る遺伝子転写物(e)配列番号12で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子転写物(f)配列番号3で示される塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下にハイブリダイズし得る遺伝子転写物(以下、一括して本遺伝子転写物という)である。ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば、6×SSC(0.9M NaCl、0.09Mクエン酸ナトリウム)、5×デンハルト溶液(0.1%(w/v) フィコール400、0.1%(w/v) ポリビニルピロリドン、0.1%BSA)、0.1%(w/v) SDS,100μg/ml変性サケ精子DNA、50%ホルムアミド存在下、あるいは100μg/ml変性サケ精子DNAを含むDIG EASY Hyb溶液(ベーリンガーマンハイム社)中で、50℃で保温し、次いで2×SSC、0.1%SDS、室温、15分間の保温を2回行い、さらに0.1%×SSC、0.1%SDS、68℃、30分間で保温する条件をあげることができる。本遺伝子転写物としては、具体的には例えば、配列番号10で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子転写物、配列番号10で示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子転写物、配列番号1で示される塩基配列[t(チミン)をu(ウラシル)に読み替える]を含む遺伝子転写物、配列番号11で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子転写物、配列番号11で示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子転写物、配列番号2で示される塩基配列[t(チミン)をu(ウラシル)に読み替える]を含む遺伝子転写物、配列番号12で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子転写物、配列番号12で示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子転写物、配列番号3で示される塩基配列[t(チミン)をu(ウラシル)に読み替える]を含む遺伝子転写物、前記のいずれかの塩基配列の部分配列を含む遺伝子産物等があげられる。ここで、前記の「アミノ酸の欠失、置換もしくは付加」には、例えば、当該遺伝子産物が由来する動物の種差、系統差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異等が含まれる。また、「部分配列を含む遺伝子産物」には、例えば、前記塩基配列を含む遺伝子産物が細胞内でプロセシングを受けて生じた遺伝子産物等が含まれる。
【0007】腹腔内脂肪組織における本遺伝子転写物の発現レベルは、例えば、腹腔内脂肪組織における発現量が恒常的に一定であることが知られている遺伝子(以下、対照遺伝子と記す。)の転写物の量に対する本遺伝子転写物の量の相対値で表わすことができる。対照遺伝子としては、例えば、β-actin(Nucl.Acids.Res., vol.12,No.3, p.1687,1984)遺伝子や36B4(Acidic Ribosomal Phosphoprotein)(Nucl.Acids.Res., vol.19,No.14, p.3998,1991)遺伝子等をあげることができる。腹腔内脂肪組織中の本遺伝子転写物の量は、例えば、対象となる動物の腹腔内脂肪組織由来のRNAについて、配列番号1で示される塩基配列、配列番号2で示される塩基配列もしくは配列番号3で示される塩基配列に基づいて調製されたプローブもしくはプライマーを使用して、ノザンハイブリダイゼーション法、RT-PCR法、in situハイブリダイゼーション法などを行うことにより測定することができる。対照遺伝子の転写物の量も同様の手法により測定することができる。これらの方法は、例えば、J.Sambrook, E.F.Frisch,T.Maniatis著;モレキュラー・クローニング第2版(Molecular Cloning 2nd edition)、コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)発行、1989年等に記載の通常の遺伝子工学的方法に準じて行うことができる。
【0008】(1)ノザンハイブリダイゼーション法測定対象となる動物から採取された腹腔内脂肪組織から、例えば、塩酸グアニジン/フェノール法、SDS−フェノール法、グアニジンチオシアネート/CsCl法等の通常の方法によって全RNAを抽出する。例えばISOGEN(ニッポンジーン製)等の市販のキットを利用してもよい。抽出された全RNAから、例えば、以下のようにしてmRNAを調製する。まず、オリゴdTをリガンドとして有するポリAカラムを5倍カラム容量以上のLoading buffer(20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.6)、0.5MNaCl、1mMEDTA、0.1%(w/v) SDS)を用いて、平衡化し、続いて前述の方法で調製した全RNAをカラムにかけ、10倍カラム容量のloading bufferで洗浄する。さらに5倍カラム容量のWashing buffer(20mMトリス塩酸緩衝液(pH7.6)、0.1MNaCl、1mMEDTA、0.1%(w/v) SDS)で洗浄する。続いて、3倍カラム容量のelution buffer(10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.6、1mMEDTA、0.05%(w/v) SDS)でmRNAを溶出させる。ノサ゛ンハイフ゛リタ゛イセ゛ーションに用いるフ゜ローフ゛を調製するには、例えば、まず、配列番号1で示される塩基配列、配列番号2で示される塩基配列もしくは配列番号3で示される塩基配列に基づいて調製されたプライマーを設計・合成し、該プライマーを用いて前記のようにして調製された腹腔内脂肪組織由来の全RNAあるいはmRNAを鋳型としてRT−PCR法を行うことにより、配列番号10〜12で示されるアミノ酸配列またはその一部をコードする塩基配列を有するDNAを調製するとよい。具体的には、まず、オリゴdTプライマーを前記全RNAあるいはmRNAのポリA鎖にアニールさせ、例えばcDNA合成キット(宝酒造)のプロトコールに従って、一本鎖cDNAを合成する。この時、鋳型とするRNAは、全RNAあるいはmRNAのどちらでも良いが、mRNAを用いる方がより好ましい。続いて合成された一本鎖DNAを鋳型にして、例えば配列番号4で示される塩基配列(配列番号1で示される塩基配列の塩基番号131〜150で表される塩基配列に相当する)からなるオリゴヌクレオチドと配列番号5で示される塩基配列(配列番号1で示される塩基配列の塩基番号1070〜1091で表される塩基配列に相補的な塩基配列に相当する)からなるオリゴヌクレオチド、配列番号6で示される塩基配列(配列番号2で示される塩基配列の塩基番号144〜164で表される塩基配列に相当する塩基配列の5'側にEcoRI認識配列が付加された塩基配列)からなるオリゴヌクレオチドと配列番号7で示される塩基配列(配列番号2で示される塩基配列の塩基番号1946〜1972で表される塩基配列に相補的な塩基配列に相当する)からなるオリゴヌクレオチド、または、配列番号8で示される塩基配列(配列番号3で示される塩基配列の塩基番号188〜205で表される塩基配列に相当する)からなるオリゴヌクレオチドと配列番号9で示される塩基配列(配列番号3で示される塩基配列の塩基番号909〜930で表される塩基配列に相補的な塩基配列に相当する)からなるオリゴヌクレオチド等をプライマーとして、TAKARAtaq(宝酒造社)等のDNAホ゜リメラーセ゛を用いてPCR反応することにより、DNAを増幅する。PCRの条件は、測定対象とする動物の種類、使用するフ゜ライマーの配列などにより異なるが、代表的な反応条件を挙げると、例えば、反応緩衝液(10mMトリス塩酸緩衝液(pH8.3)、50mMKCl,1.5mM MgCl2)中、2.5mMNTP存在下で、94℃,30秒間、次いで40〜60℃,2分間、さらに72℃,2分間の保温を1サイクルとして30〜55サイクル行う。このようにして増幅されたDNAはpUC118などのベクターに挿入してクローニングしておいてもよい。該DNAの塩基配列は、Maxam Gilbert 法 (例えば、Maxam,A.M&W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci.,74,560,1977 等に記載される) やSanger法(例えばSanger,F.&A.R.Coulson,J.Mol.Biol.,94,441,1975 、Sanger,F,&Nicklen and A.R.Coulson., Proc.Natl.Acad.Sci.,74,5463,1977等に記載される)により確認することができる。このようにして調製されたDNAまたはその一部を、放射性同位元素や蛍光色素等で標識することによりプローブを調製することができる。例えば、前記のようにして調製されたDNAを鋳型とし、該DNAの塩基配列の部分配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、[α-32P]dCTPあるいは[α-32P]dATPを含むdNTPを反応液に添加してPCRを行うことにより32Pで標識されたプローブが得られる。また、前記のようにして調製されたDNAを、例えば、Random prime labeling(ヘ゛ーリンカ゛ーマンハイム社)、MEGALABEL(宝酒造社)等の市販の標識キットを用いて標識してもよい。前記のようにして調製されたプローブを使用して、ノザンハイブリダイゼーション分析を行う。具体的には例えば、腹腔内脂肪組織由来の全RNA20μgあるいはmRNA2μgをアガロースゲルで分離し、10xSSC(1.5MNaCl、0.35Mクエン酸ナトリウム)で洗浄後、市販のナイロンメンブラン、Hybond−N(アマシャム製)に移す。ポリエチレン袋にメンブランを入れ、ハイブリダイゼーションバッファー〔6×SSC(0.9M NaCl、0.21 Mクエン酸ナトリウム)、5×デンハルト溶液(0.1%(w/v)フィコール400、0.1%(w/v) ポリビニルピロリドン、0.1%BSA 、0.1%(w/v) SDS,100μg/ml変性サケ精子DNA、50%ホルムアミド〕25 mlを加えて、50℃、2時間インキュベートした後、ハイブリダイゼーションバッファーを捨て、新たに2〜6mlのハイブリダイゼーションバッファーを加える。更に前記方法で得られた標識プローブを加え、50℃、一晩インキュベートする。ハイブリダイゼーションバッファーとしては、上記のほかに、市販のDIG EASY Hyb(ベーリンガーマンハイム社)などを用いることができる。メンブランを取り出して、50 〜100mlの2×SSC、0.1%SDS中で室温、15分間インキュベート、さらに同じ操作を1回繰り返し行い、最後に50〜100 mlの0.1×SSC、0.1% SDS中で68℃、30分間インキュベートし、メンブラン上の標識量を定量することにより、本遺伝子転写物の量を測定することができる。さらに、同様の操作を、対照遺伝子、たとえばβ-actin や36B4遺伝子等について行い、対照遺伝子の転写物の量を測定する。対照遺伝子の転写物量当たりの本遺伝子転写物量の相対値を算出することにより、本遺伝子転写物の腹腔内脂肪組織における発現レベルを求めることができる。
【0009】(2)RT-PCR反応腹腔内脂肪組織から上記(1)と同様の方法でmRNAを調製し、精製されたmRNAに例えばMMLV(東洋紡社)等の逆転写酵素を添加し、反応緩衝液(50 mMトリス塩酸緩衝液(pH 8.3)、3 mM MgCl2 、75 mM KCl、10 mM DTT)中、0.5 mMdNTPおよび25μg/mlオリゴdT存在下で42℃、15分〜1時間反応させ、対応するcDNAを調製する。あるいはcDNA合成キット(宝酒造)を用いて対応するcDNAを調製しても良い。調製されたcDNAを鋳型にして、例えば配列番号4で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号5で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、配列番号6で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号7で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、または、配列番号8で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号9で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド等をプライマーとしてPCRを行う。PCRの条件としては、例えば、TAKARA taq(宝酒造社)を使用し、反応緩衝液(10 mMトリス塩酸緩衝液pH 8.3)、50 mM KCl,1.5 mM MgCl2)中、2.5 mM dNTPおよび[α32P]-dCTP存在下で、例えば、94℃,30秒間、次いで40〜60℃,2分間、さらに72℃,2分間の保温を1サイクルとしてこれを30〜55サイクル行う条件をあげることができる。かかるPCRにより増幅されたDNAをポリアクリルアミドゲル電気泳動し、分離されたDNAバンドの放射活性量を定量する。同様の操作を、対照遺伝子、例えばβ-アクチンや36B4について行い、対照遺伝子の転写物の放射活性量を求める。対照遺伝子の転写物由来の放射活性量当たりの本遺伝子転写物由来の放射活性量の相対値を算出することにより、本遺伝子転写物の腹腔内脂肪組織における発現レベルを求めることができる。
【0010】(3)In situハイブリダイゼーション法基本的には1)組織の固定包埋及び切片の作製2)フ゜ローフ゛の調製3)ハイフ゛リタ゛イセ゛ーションによる検出からなりあらかじめ放射性もしくは非放射性物質で標識されたRNA叉はDNAをフ゜ローフ゛とすること以外は例えばHeiles,H.et al., Biotechniques,6,978,1988遺伝子工学ハント゛フ゛ック 羊土社 278 1991細胞工学ハント゛フ゛ック,羊土社,214,1992細胞工学ハント゛フ゛ック,羊土社,222,1992等に記載される方法に準じて行うことができる具体的には腹腔内脂肪組織をハ゜ラホルムアルテ゛ヒト゛等で固定し、ハ゜ラフィン等に包埋した後薄切切片を作製しスライト゛ク゛ラスに張り付けるこのようにしてスライト゛ク゛ラ切片を得る次にRNAフ゜ローフ゛を調製する場合にはまず例えば前記(1)と同様にして配列番号10〜12で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNAを取得し、該DNAをSP6T7T3RNAホ゜リメラーセ゛フ゜ロモーターをもったヘ゛クター(例えばStratagene社のBluescriptPromega社のpGEMなど)に組み込んで大腸菌に導入し、フ゜ラスミト゛DNAを調製する次いで、センス(ネカ゛ティフ゛コントロール用)、アンチセンス(ハイフ゛リタ゛イセ゛ーション用)RNAができるようにフ゜ラスミト゛DNAを制限酵素で切断するこれらDNAを鋳型とし放射性標識の場合はα-35S-UTP等非放射性標識の場合はテ゛ィコ゛キシケ゛ニンUTPあるいはフルオレセイン修飾UTP等を基質としてSP6T7T3RNAホ゜リメラーセを用いてRNAを合成標識し、アルカリ加水分解によりハイフ゛リタ゛イセ゛ーションに適したサイス゛に切断することによってあらかじめ放射性もしくは非放射性物質で標識されたRNAを調製するなおこれらの方法に基づいたキットとしては例えば放射性標識用にはRNAラヘ゛リンク゛キット(アマシャム社)が非放射性標識用にはDIG RNAラヘ゛リンク゛キット(ヘ゛ーリンカ゛ー・マンハイム社)やRNAカラーキット(アマシャム社)が市販されているまたDNAフ゜ローフ゛を調製する場合には例えば32P等で標識した放射性ヌクレオチト゛もしくはヒ゛オチン、テ゛ィコ゛キシケ゛ニンあるいはフルオレセインで標識したヌクレオチト゛、ニックトランスレーション法(J.Mol.Biol.,113,237,Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.,10,6-10,12,Cold Spring Harbor Lab.)あるいはランタ゛ムフ゜ライム法(Anal.Biochem., 132,6,Anal.Biochem.,137,266 )によって取り込ませることによってあらかじめ放射性もしくは非放射性物質で標識されたDNAを調製するこれらの方法に基づいたキットとしては例えば放射性標識用にはニックトランスレーションキット(アマシャム社)やRandom Prime Labeling Kit(ベーリンガーマンハイム社)が非放射性標識用にはDIG DNA標識キット(ベーリンガーマンハイム社)DNAカラーキット(アマシャム社)等が市販されている次に腹腔内脂肪組織中にあって使用されるフ゜ローフ゛と非特異的に反応する物質を除去するために前記のようにして作製されたスライト゛ク゛ラス切片をフ゜ロテイナーセ゛K処理し、アセチル化する前記のようにして調製されたフ゜ローフ゛ハイフ゛リタ゛イセ゛ーション(例えば上記のフ゜ローフ゛を90℃で3分間加熱した後ハイフ゛リタ゛イセ゛ーション溶液で希釈し該溶液を前処理の終了したスライト゛ク゛ラス切片上に滴下してフィルムでおおい、モイスチャーチャンハ゛ー中で45℃16時間保温することにより、ハイフ゛リット゛を形成させる)を行ったあと非特異的吸着あるいは未反応フ゜ローフ゛を洗浄等(RNAフ゜ローフ゛を用いた場合はRNase処理も加える)により除去する。ハイフ゛リット゛を各標識に応じた方法によって検出する35Sあるいは32P等で標識した放射性フ゜ローフ゛を用いる場合は、ハイフ゛リタ゛イス゛したスライト゛ク゛ラス切片をエマルシ゛ョン(コタ゛ック社製NTB3あるいはNTB10等)液に浸した後固化し感光暗箱に入れ4℃で4-50日感光させ現像に続いてトルイシ゛ンフ゛ル-染色することによりシク゛ナルを検出する。ヒ゛オチンヌクレオチト゛で標識した非放射性フ゜ローフを用いる場合は、ストレフ゜トアヒ゛シ゛ンを介してヒ゛オチンアルカリホスファターセ゛による酵素標識後基質であるニトロフ゛ルーテトラソ゛リウム(NBT)および5-フ゛ロモ-4-クロロ-3-イント゛リルリン酸を加え酵素反応による基質の発色を顕微鏡観察してシク゛ナルを検出するまた、テ゛ィコ゛キシケ゛ニンあるいはフルオレセインで標識した非放射性フ゜ローフ゛を用いる場合は、アルカリホスファターセ゛等の酵素で標識した抗テ゛ィコ゛キシケ゛ニン抗体あるいは抗フルオレセイン-アルカリホスファターセ゛複合体を介して酵素標識後上記同様に酵素反応による基質の発色を顕微鏡観察してシク゛ナルを検出する必要に応じて遺伝子の発現を検出する精度をさらに高める場合、フ゜ローフ゛ハイフ゛リタ゛イス゛形成時の温度、スライト゛ク゛ラス切片洗浄時の温度や洗浄液の組成等を変化させて対照実験を行い同一な挙動を示すか否かを調べることにより可能である同様の操作を、対照遺伝子、例えばβ-アクチン遺伝子や36B4遺伝子についても行う。そして、対照遺伝子の標識シク゛ナル量当たりの本遺伝子転写物の標識シク゛ナル量を算出することにより、本遺伝子転写物の腹腔内脂肪組織における発現レベルを求めることができる。
【0011】本発明において、被験動物の腹腔内の脂肪組織量を推定するには、被験動物と同じ種の動物の腹腔内脂肪組織における本遺伝子転写物の発現レベルと、該動物の腹部臍位横断面の腹腔内脂肪組織面積値との相関関係に基づき、被験動物由来の腹腔内脂肪組織試料における前記遺伝子転写物の発現レベルから該動物の前記面積値を求める。腹腔内脂肪組織における本遺伝子転写物の発現レベルと、腹部臍位横断面の腹腔内脂肪組織面積値との相関関係は、例えば次のようにして求められる。腹腔内脂肪組織における本遺伝子転写物の発現レベルは、前述のような方法により、複数の個体について測定される。一方、該発現レベルの測定された各個体の腹腔内の脂肪組織面積値は、例えばCTスキャン法、(Int. J. Obes.,vol 7,p.437, 1983)、超音波検査法、磁気共鳴映像法(MRI)(症状から見た画像診断;日本医師会編)等による腹部臍位横断面撮影像から求められる。各個体の腹腔内脂肪組織における本遺伝子転写物の発現レベルがX軸に、腹部臍位横断面の腹腔内脂肪組織面積値がY軸にプロットされると、本遺伝子転写物の発現レベルと腹部臍位横断面における腹腔内脂肪組織面積値とは正の相関関係を示し、こうして得られた複数のプロットから、統計学的処理により2つの値の間の相関関係式、Y=aX+bが求められる。ここで、プロット数が多いほど該相関関係式の信頼性が高まる。被験動物の腹腔内の脂肪組織量を推定するには、該動物の腹腔内脂肪組織試料における前記遺伝子転写物の発現レベルを測定する。先に求められた相関関係式Y=aX+bのXにその値を代入して演算することにより、被験動物の腹部臍位横断面における腹腔内脂肪組織面積値を表すYの値を求めることができる。腹腔内の脂肪組織の総量は、腹部臍位横断面における腹腔内脂肪組織が占める面積値と比例する(Int.J. Obesity, vol.17, p.187, 1993)ことが知られており、よって、該面積値の大小から腹腔内の脂肪組織量の多少を推定することができる。さらに、上記のようにして求められた腹腔内の脂肪組織面積値(cm2)をもって、糖または脂質代謝異常、またはそれらを引き金とする高脂血症、動脈硬化、心血管障害などの病態発症の危険性を評価する目安としてもよい(内臓脂肪型肥満,1995、医薬ジャーナル社刊)。また、同一被験動物における腹腔内の脂肪組織量の増減を次のようにして推定することもできる。すなわち、被験動物の腹腔内脂肪組織試料における本遺伝子転写物の発現レベルを測定し、その測定値を記録しておく。該発現レベルは、腹部臍位横断面における腹腔内脂肪組織面積値と正の相関関係にあり、さらに該面積値は腹腔内の脂肪組織量と正の相関関係にあるので、該発現レベルの減少は腹腔内の脂肪組織量の減少を意味し、また、その増加は、腹腔内の脂肪組織量の増加を意味する。そこで、被験動物の腹腔内脂肪組織試料における本遺伝子転写物の発現レベルを経時的に測定し、前回の測定値と比較することにより、被験動物の腹腔内の脂肪組織量の増減を知ることができる。上記のような本発明の方法が適用可能な動物としては、例えば、ヒト、サルをはじめとする哺乳動物をあげることができる。
【0012】
【実施例】以下に本発明を実施例および参考例で説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
参考例1 (ヒト腹腔内脂肪組織からの全RNA抽出)
ヒト腹腔内脂肪組織よりグアニジンチオシアネート(GTC)/セシウムクロライド(CsCl)法(Chirgwin,J.M. et al Biochemistry,18,5294,1979 )により全RNAを調製した。すなわち、上記の各組織をPBS(0.1 Mリン酸緩衝液,pH7.0)で洗い、20mlのGTC溶液(4Mグアニジンチオシアネート、25 mMクエン酸ナトリウム,pH7.0、0.5%(w/v) ザルコシル硫酸ナトリウム、0.1 M 2-メルカプトエタノール)に懸濁し、Vortexミキサーにて混合した。遠心チューブ容量の1/2のCsCl溶液(5.7 M CsCl、0.1 M EDTA、pH 7.0)を入れ、その上にGTC懸濁液を重層し、超遠心分離(275,000g,20時間 ,18℃)を行った。沈殿に300μlの70%(v/v)エタノールを加えしばらく放置後RNAの沈殿を回収した回収されたRNAは200μlのTES緩衝液(10mMトリス塩酸,pH7.45mMEDTA1%(w/v) SDS)に溶かし同量のクロロホルム/1-フ゛タノール(4/1v/v)を加えよく撹拌した後遠心分離(12,000 g,5分間 ,18℃)により二層に分けた上層を回収し0.1容量の3M酢酸ナトリウムと2倍量のエタノールを加え、エタノール沈殿を行った沈殿をTE緩衝液 ( 10 mM トリス塩酸、pH 7.41 mM EDTA)で溶解し全RNAを取得した得られた全RNA量は、分光光度計にて測定された260nmの吸収値から計算した。
【0013】参考例2 (フ゜ローフ゛用DNAの調製1)
参考例1に記載の方法にて抽出された全RNA1.0μgを鋳型にして、cDNA合成キット(宝酒造)添付のオリゴdTプライマーを混合後、1mMdNTPの存在下でMMTV逆転写酵素50ユニットを添加し、室温で10分間、次いで42℃、15分間、さらに99℃、5分間保温することによって、1本鎖cDNAを合成した。続いて合成された1本鎖cDNA1.0〜 2.0 ngを鋳型にして、配列番号4で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号5で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを゜ライマーとして、200μM dNTP、1.5 mM MgCl2存在下でDNAポリメラーゼ(パーキンエルマー社)1ユニットを添加し、94℃、1分間、次いで55℃、1分間、さらに72℃、2分間の保温を1サイクルとしてこれを55サイクル行う条件下でPCR反応を行った。得られたPCR反応産物を1%アカ゛ロースケ゛ル電気泳動し、(泳動バッファー;トリスー硼酸緩衝液(ナカライテスク社))、増幅された961bpのDNAバンドをゲルから切り出し、J. Sambrook 、E.F.Fritsch 、T.Maniatis著:「Molecular Cloning Second Edition」、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989年)に記載されている方法により、プラスミドベクターpUC118(宝酒造社)のHincIIサイトにサブクローニングし、プラスミドpUCh085(図1)を得た。そして該クローンの挿入断片の塩基配列を、Taq Dye Primer Cycle Sequencing Kit 及びTaq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems製) を用いてApplied Biosystems製の373A DNA Sequencerにより決定した。その結果、該クローンの挿入断片は配列番号1で示される塩基配列の塩基番号131〜1091で表される塩基配列を有することが確認された。
【0014】参考例3 (フ゜ローフ゛用DNAの調製2)
参考例2で合成された1本鎖cDNA 1.0〜2.0 ngを鋳型にして、配列番号6で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号7で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをフ゜ライマーとして、200μM dNTP、1.5 mM MgCl2存在下でDNAポリメラーゼ(パーキンエルマー社)1ユニットを添加し、94℃、1分間、次いで58℃、1分間、さらに72℃、2分間の保温を1サイクルとしてこれを55サイクル行う条件下でPCR反応を行う。得られたPCR反応産物をEcoRI消化した後、1%アカ゛ロースケ゛ル電気泳動し(泳動バッファー;トリスー硼酸緩衝液(ナカライテスク社))、増幅された1,826 bpのDNAバンドをゲルから切り出し、J. Sambrook、E.F.Fritsch 、T.Maniatis著:「Molecular Cloning Second Edition」、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989年)に記載されている方法により、プラスミドベクターpUC118(宝酒造社)のEcoRIサイトにサブクローニングし、プラスミドpUCh101(図2)を得る。該クローンの挿入断片は配列番号2で示される塩基配列の塩基番号144〜1969で表される塩基配列を有する。
【0015】参考例4(フ゜ローフ゛用DNAの調製3)
参考例2で合成された1本鎖cDNA 1.0〜2.0 ngを鋳型にして、配列番号8で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号9で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをフ゜ライマーとして、200μM dNTP、1.5 mM MgCl2存在下でDNAポリメラーゼ(パーキンエルマー社)1ユニットを添加し、94℃、1分間、次いで55℃、1分間、さらに72℃、2分間の保温を1サイクルとしてこれを55サイクル行う条件下でPCR反応を行った。得られたPCR反応産物を1%アカ゛ロースケ゛ル電気泳動し、(泳動バッファー;トリスー硼酸緩衝液(ナカライテスク社))、増幅された743bpのDNAバンドをゲルから切り出し、J. Sambrook 、E.F.Fritsch 、T.Maniatis著:「Molecular Cloning Second Edition」、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989年)に記載されている方法により、プラスミドベクターpUC118(宝酒造社)のHincIIサイトにサブクローニングし、プラスミドpUCh056(図3)を得た。そして該クローンの挿入断片の塩基配列を、Taq Dye Primer Cycle Sequencing Kit 及びTaq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems製) を用いてApplied Biosystems製の373A DNA Sequencerにより決定した。その結果、該クローンの挿入断片は配列番号3で示される塩基配列の塩基番号188〜930で表される塩基配列を有することが確認された。
【0016】実施例1 (ノザンハイブリダイゼーションを用いた遺伝子転写物量の測定)
参考例2で得られたプラスミドpUCh085の挿入断片を鋳型として、参考例2に記載の条件(但し、反応を30サイクルとした)でPCR反応を行い、挿入断片のDNAを増幅した(増幅されたDNAを、以下、フ゜ローフ゛DNA1と記す。)。また、参考例4で得られたプラスミドpUCh056の挿入断片を鋳型として、参考例4に記載の条件(但し、反応を30サイクルとした)でPCR反応を行い、挿入断片のDNAを増幅した(増幅されたDNAを、以下、フ゜ローフ゛DNA3と記す。)。また、参考例3で得られたプラスミドpUCh101をEcoRI、EcoT14Iで消化し、1,161 bpのDNA(配列番号2で示される塩基配列の塩基番号144〜1,304で表される塩基配列からなる。以下、フ゜ローフ゛DNA2と記す。)をアカ゛ロースケ゛ル電気泳動により分離し、回収した。一方、対照遺伝子とする36B4遺伝子の転写物を検出するためのDNA(637bp)は、データベースに登録されている該遺伝子の塩基配列(GenBankアクセッション番号、M17885;全長 1097bp)のうち、塩基番号329〜349で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、塩基番号942〜965で表される塩基配列に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとをフ゜ライマーとして、PCR反応(94℃、1分間、次いで57℃、1分間、さらに72℃、2分間の保温を1サイクルとしてこれを55サイクル)を行うことにより増幅した(増幅されたDNAを、以下、対照DNAと記す。)。調製したこれらのDNAの32P標識は、市販の放射能標識キット(Random Prime Labeling Kit,ベーリンガーマンハイム社)を使用して、基質として[α-32P]dCTP、dATP,dTTP,dGTPの存在下でプロトコールに従い行った。腹腔内脂肪組織試料から、参考例1と同様の方法で全RNAを調製した。この全RNAそれぞれ20μgをホルムアルデヒド含有アガロースゲル電気泳動に供し、泳動後のゲルを10×SSC(1.5M NaCl、0.15M クエン酸ナトリウム)で洗浄した後市販のナイロンメンブランHybond-N(アマシャム社)にキャピラリー法でブロッティングした 次いで、ポリエチレン袋に前記メンブランを入れ、DIG EASY Hyb溶液(ベーリンガーマイハイム社)に100μg/ml変性サケ精子DNA 5mlを加えて、50℃、2時間インキュベートした後、溶液を捨て、新たに2〜3 mlの100μg/ml変性サケ精子DNA入りDIG EASY Hyb溶液を加えた。更に前記方法で得られた32P標識したDNAプローブを加え、50℃、一晩インキュベートした。メンブランを取り出して、50mlの2×SSC、0.1%SDS中で室温、15分間インキュベート、さらに同じ操作を1回行い、50〜100mlの0.1×SSC、0.1%(w/v) SDS中で68℃、30分間インキュベートして洗浄後、イメージアナライザーBAS2000(FUJIフィルム社)を用いてメンブラン上の標識活性を測定することにより、フ゜ローフ゛DNA1〜3とハイフ゛リタ゛イス゛したシク゛ナルを検出した。その結果、フ゜ローフ゛DNA1については、2.4、3.4および4.7kbの位置にシク゛ナルが検出された。また、フ゜ローフ゛DNA2については、3.0kb、フ゜ローフ゛DNA3については6.6kbの位置にそれぞれシク゛ナルが検出された。さらに、各シク゛ナルの強度を、イメージアナライザーBAS2000(FUJIフィルム社)を用いて定量した。上記の処理を行ったメンブランを、さらに、0.5%SDS存在下に100℃で20分間保温する操作を2回行うことにより、メンブラン上に結合している32P標識DNAフ゜ローフ゛を除去し、その後、32P標識した対照DNAを用いて、同様の操作でハイブリダイズシグナルを測定した。その結果、いずれのメンブランについても、1.4kbの位置にシク゛ナルが検出された。これらのシク゛ナの強度を、イメージアナライザーBAS2000(FUJIフィルム社)を用いて定量した。フ゜ローフ゛DNA1〜3について検出されたシク゛ナルの強度(複数のシク゛ナルが検出された場合はそのシク゛ナル強度の和)をそれぞれ、対照DNAについて検出されたシク゛ナルの強度で除し、得られた値をフ゜ローフ゛DNA1〜3で検出された遺伝子転写物の発現レベルとした。
【0017】参考例5(In situハイブリダイゼーション法を用いた遺伝子転写物量の測定)
ヒト腹部組織片を氷冷した4%(w/v) パラホルムアルデヒド/PBS緩衝液(130 mM NaCl、7mM Na2 HPO4 ,3 mM NaH2PO4・2H2O)で4℃、6時間固定する。固定標本を30%(w/v) sucrose/PBS緩衝液に移し、4℃、4時間ゆっくり振盪する。水滴を除去した前組織片を、包埋材(O.C.T. compound Miles社)に入れ、軽くかき混ぜ、組織片に残っている水分を取り除く。新しい包埋材に包埋したら、ドライアイス/エタノールで急速凍結する。クリオスタットで凍結切片を作製する。凍結切片はゼラチンコートしたスライドグラスに張り付け、直ちにドライヤーの温風にさらして乾燥させる。37℃、1時間風乾後、45℃、2時間乾燥する。配列番号1で示される塩基配列のの塩基番号28〜1500で表される塩基配列を有するセンスDNAおよび該塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンスDNAをSP6ポリメラーゼプロモーターを持ったベクターBluescript(Stratagene社)に挿入し、得られたプラスミドを適当な制限酵素で切断後、1%(w/v) SDS、200μg/mlプロテイナーゼKを含む溶液200μl中で37℃、30分間処理する。5MNaCl溶液20μlを加えたあとフェノール/クロロフォルム抽出を行い、続いてエタノール沈澱を行う。風乾後TE溶液(10 mMTris-HClpH8.0、0.1 mM EDTA)に溶解し、鋳型DNAを得る。プローブとなるRNAはDIG RNAラベリングキット(ベーリンガー社)を用いて合成を行う。すなわち、テンプレートDNA 1μg、2μMNTP、1μMディゴキシゲニンUTP、RNAseインヒビター20units存在下でRNAポリメラーゼ40unitsを添加し、37℃、2時間反応を行う。つづいて、反応液にRNAseフリーtRNA 10μg,RNAseフリーDNase30unitsを加え、37℃10分間反応し、テンプレートDNAを除去する。反応液をエタノール沈澱し、乾燥後10mMDTT溶液50μlに溶かす。この溶液に50μlの加水分解緩衝液(80 mM NaHCO3、120 mM Na2CO3、10mMDTT)を加え、60℃、20分間加水分解する。反応終了後、エタノール沈澱を行い、加水分解物を回収する。ヒト腹部組織片の前処理は、スライドグラス切片を、0.35Triton−X5分間、PBS5分間3回、0.2NHCl20分間、プロテイナーゼK1μg/ml37℃、5分間、PBS5分間3回、4%(w/v) パラホルムアルデヒド5分間、2mg/mlグリシン15分間2回、50%(w/v) 脱イオン化ホルムアミド1時間浸して処理する。ハイブリダイゼーションは、85℃保温したハイブリダイゼーション溶液(50%ホルムアミド、10mMトリスHCl緩衝液pH7.6、1mMEDTA、600mMNaCl、10mMDTT、1xデンハルト(0. 02%(W/V) フィコール、0. 02%(w/v) ポリビニルピロリドン、0. 02%(w/v) ウシ血清アルブミン)、0.25%(w/v) SDS、10%(w/v)デキストラン硫酸、200μg/ml E.coli tRNA)でプローブを100倍希釈し、これを前処理したスライドグラス切片上に滴下し、パラフィルムでおおい、50℃、16時間保温する。ハイブリダイゼーション終了後、1)2XSSC、50%ホルムアミド(v/v) 、50mMDTT、50℃、30分間、2)10mMトリス塩酸緩衝液pH7.6、500mMNaCl、1mMEDTA、37℃、15分間、3)10mMトリス塩酸緩衝液pH7.6、500mMNaCl、1mMEDTA、25μ/mlRNaseA 37℃、30分間、4)10mMトリス塩酸緩衝液pH7.6、500 mMNaCl、1mM EDTA、37℃、10分間、5)2XSSC、50℃、20分間2回、6)0.2xSSC、50℃、20分間2回の順で洗浄していく。洗浄の終了したスライドグラス切片を以下に示す溶液に通して、抗体反応、発色反応を行う。1)DIG緩衝液1(100 mMTris-HClpH7.5、150 mM NaCl)、2分間、2)1.5%ブロッキング液(ベーリンガー社)60分間、3)DIG緩衝液で5000倍希釈したanti-DIGアルカリフォスファターゼ−ディゴキシゲニン抗体を添加し、30分間、4)DIG緩衝液1で15分2回洗浄する、5)DIG緩衝液3(100 mMTris-HClpH9.5、100 mM NaCl、50 mM MgCl2)5分間インキュベート、6)337.5μg/ml]NTBを添加し、37℃、1時間発色させる、7)10 mM Tris-HCl緩衝液pH7.5、1 mM EDTA溶液で反応を停止する。顕微鏡観察によって発色強度を求める。同様の操作を、対照遺伝子である36B4遺伝子について行い、対照遺伝子産物に由来する発色強度に対する目的遺伝子産物由来の発色強度の比を計算し、目的遺伝子産物の腹腔内脂肪組織中の発現レベルを求める。
【0018】実施例2 (腹腔内脂肪組織における本遺伝子転写物の発現レベルと腹腔内脂肪組織面積値との相関関係の算出)
腹部臍位横断面の断層撮影像から腹腔内脂肪面値が算出されている11ないし12のヒト個体から採取された腹腔内脂肪組織試料について、実施例1の方法にて、フ゜ローフ゛DNA1〜3で検出された遺伝子転写物の発現レベルを求めた。各個体につき、フ゜ローフ゛DNA1〜3で検出された遺伝子転写物の発現レベルをX軸に、腹腔内脂肪組織面積値(cm2)をY軸にフ゜ロットした。統計処理演算式に基づいて、遺伝子転写物の発現レベルと腹腔内脂肪組織面積値の間の相関係数を求めた結果、フ゜ローフ゛DNA1で検出された遺伝子転写物に関しては、相関係数r=0.47、フ゜ローフ゛DNA2で検出された遺伝子転写物に関しては、相関係数r=0.59、フ゜ローフ゛DNA3で検出された遺伝子転写物に関しては、相関係数r=0.73であり、各遺伝子転写物の発現レベルは、腹腔内脂肪組織面積値と正の相関関係にあった(図5〜7)。また、これらのプロットから導かれたXとYとの間の相関関係式は、フ゜ローフ゛DNA1で検出された遺伝子転写物ではY= 297.2xX+39.9、フ゜ローフ゛DNA2で検出された遺伝子転写物ではY= 542.1xX+53.3、フ゜ローフ゛DNA3で検出された遺伝子転写物ではY= 286.5xX+45.4であった。このようにしてフ゜ローフ゛DNA1〜3のうち1以上のDNAを用いて、該DNAで検出される遺伝子転写物の発現レベルと腹腔内脂肪組織面積値との相関関係式を求める。一方、被験動物の腹腔内脂肪組織試料について、該DNAで検出される遺伝子転写物の発現レベルを実施例1または参考例5の方法で測定する。測定された発現レベルを前記相関関係式のXに代入して演算することにより、被験動物の腹腔内脂肪組織面積値を予測することができる。
【0019】
【発明の効果】本発明により、高価な特別の装置を必要とせず、また、皮下脂肪組織量とは係りなく腹腔内脂肪組織量を推定することのできる方法が提供可能となる。
【0020】(配列表フリーテキスト)
配列番号4PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー配列番号5PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー配列番号6PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー配列番号7PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー配列番号8PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー配列番号9PCRのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー【0021】
【配列表】
<110> Sumitomo Chemical Co. Ltd. <120> Methods for evaluating intraabdominal adipose tissue mass <130> P150262 <160> 12 <210> 1 <211> 2376<212> DNA<213> Homo sapiens <221> CDS <222> (28)..(1500) <400> 1 cgcgcggccc ctgtcctccg gcccgag atg aat cct gcg gca gaa gcc gag ttc 54 Met Asn Pro Ala Ala Glu Ala Glu Phe 1 5 aac atc ctc ctg gcc acc gac tcc tac aag gtt act cac tat aaa caa 102Asn Ile Leu Leu Ala Thr Asp Ser Tyr Lys Val Thr His Tyr Lys Gln 10 15 20 25 tat cca ccc aac aca agc aaa gtt tat tcc tac ttt gaa tgc cgt gaa 150Tyr Pro Pro Asn Thr Ser Lys Val Tyr Ser Tyr Phe Glu Cys Arg Glu 30 35 40 aag aag aca gaa aac tcc aaa tta agg aag gtg aaa tat gag gaa aca 198Lys Lys Thr Glu Asn Ser Lys Leu Arg Lys Val Lys Tyr Glu Glu Thr 45 50 55 gta ttt tat ggg ttg cag tac att ctt aat aag tac tta aaa ggt aaa 246Val Phe Tyr Gly Leu Gln Tyr Ile Leu Asn Lys Tyr Leu Lys Gly Lys 60 65 70 gta gta acc aaa gag aaa atc cag gaa gcc aaa gat gtc tac aaa gaa 294Val Val Thr Lys Glu Lys Ile Gln Glu Ala Lys Asp Val Tyr Lys Glu 75 80 85 cat ttc caa gat gat gtc ttt aat gaa aag gga tgg aac tac att ctt 342His Phe Gln Asp Asp Val Phe Asn Glu Lys Gly Trp Asn Tyr Ile Leu 90 95 100 105 gag aag tat gat ggg cat ctt cca ata gaa ata aaa gct gtt cct gag 390Glu Lys Tyr Asp Gly His Leu Pro Ile Glu Ile Lys Ala Val Pro Glu 110 115 120 ggc ttt gtc att ccc aga gga aat gtt ctc ttc acg gtg gaa aac aca 438Gly Phe Val Ile Pro Arg Gly Asn Val Leu Phe Thr Val Glu Asn Thr 125 130 135 gat cca gag tgt tac tgg ctt aca aat tgg att gag act att ctt gtt 486Asp Pro Glu Cys Tyr Trp Leu Thr Asn Trp Ile Glu Thr Ile Leu Val 140 145 150 cag tcc tgg tat cca atc aca gtg gcc aca aat tct aga gag cag aag 534Gln Ser Trp Tyr Pro Ile Thr Val Ala Thr Asn Ser Arg Glu Gln Lys 155 160 165 aaa ata ttg gcc aaa tat ttg tta gaa act tct ggt aac tta gat ggt 582Lys Ile Leu Ala Lys Tyr Leu Leu Glu Thr Ser Gly Asn Leu Asp Gly 170 175 180 185 ctg gaa tac aag tta cat gat ttt ggc tac aga gga gtc tct tcc caa 630Leu Glu Tyr Lys Leu His Asp Phe Gly Tyr Arg Gly Val Ser Ser Gln 190 195 200 gag act gct ggc ata gga gca tct gct cac ttg gtt aac ttc aaa gga 678Glu Thr Ala Gly Ile Gly Ala Ser Ala His Leu Val Asn Phe Lys Gly 205 210 215 aca gat aca gta gca gga ctt gct cta att aaa aaa tat tat gga acg 726Thr Asp Thr Val Ala Gly Leu Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Tyr Gly Thr 220 225 230 aaa gat cct gtt cca ggc tat tct gtt cca gca gca gaa cac agt acc 774Lys Asp Pro Val Pro Gly Tyr Ser Val Pro Ala Ala Glu His Ser Thr 235 240 245 ata aca gct tgg ggg aaa gac cat gaa aaa gat gct ttt gaa cat att 822Ile Thr Ala Trp Gly Lys Asp His Glu Lys Asp Ala Phe Glu His Ile 250 255 260 265 gta aca cag ttt tca tca gtg cct gta tct gtg gtc agc gat agc tat 870Val Thr Gln Phe Ser Ser Val Pro Val Ser Val Val Ser Asp Ser Tyr 270 275 280 gac att tat aat gcg tgt gag aaa ata tgg ggt gaa gat cta aga cat 918Asp Ile Tyr Asn Ala Cys Glu Lys Ile Trp Gly Glu Asp Leu Arg His 285 290 295 tta ata gta tcg aga agt aca cag gca cca cta ata atc aga cct gat 966Leu Ile Val Ser Arg Ser Thr Gln Ala Pro Leu Ile Ile Arg Pro Asp 300 305 310 tct gga aac cct ctt gac act gtg tta aag gtt ttg gag att tta ggt 1014Ser Gly Asn Pro Leu Asp Thr Val Leu Lys Val Leu Glu Ile Leu Gly 315 320 325 aag aag ttt cct gtt act gag aac tca aag ggt tac aag ttg ctg cca 1062Lys Lys Phe Pro Val Thr Glu Asn Ser Lys Gly Tyr Lys Leu Leu Pro 330 335 340 345 cct tat ctt aga gtt att caa ggg gat gga gta gat att aat acc tta 1110Pro Tyr Leu Arg Val Ile Gln Gly Asp Gly Val Asp Ile Asn Thr Leu 350 355 360 caa gag att gta gaa ggc atg aaa caa aaa atg tgg agt att gaa aat 1158Gln Glu Ile Val Glu Gly Met Lys Gln Lys Met Trp Ser Ile Glu Asn 365 370 375 att gcc ttc ggt tct ggt gga ggt ttg cta cag aag ttg aca aga gat 1206Ile Ala Phe Gly Ser Gly Gly Gly Leu Leu Gln Lys Leu Thr Arg Asp 380 385 390 ctc ttg aat tgt tcc ttc aag tgt agc tat gtt gta act aat ggc ctt 1254Leu Leu Asn Cys Ser Phe Lys Cys Ser Tyr Val Val Thr Asn Gly Leu 395 400 405 ggg att aac gtc ttc aag gac cca gtt gct gat ccc aac aaa agg tcc 1302Gly Ile Asn Val Phe Lys Asp Pro Val Ala Asp Pro Asn Lys Arg Ser 410 415 420 425 aaa aag ggc cga tta tct tta cat agg acg cca gca ggg aat ttt gtt 1350Lys Lys Gly Arg Leu Ser Leu His Arg Thr Pro Ala Gly Asn Phe Val 430 435 440 aca ctg gag gaa gga aaa gga gac ctt gag gaa tat ggt cag gat ctt 1398Thr Leu Glu Glu Gly Lys Gly Asp Leu Glu Glu Tyr Gly Gln Asp Leu 445 450 455 ctc cat act gtc ttc aag aat ggc aag gtg aca aaa agc tat tca ttt 1446Leu His Thr Val Phe Lys Asn Gly Lys Val Thr Lys Ser Tyr Ser Phe 460 465 470 gat gaa ata aga aaa aat gca cag ctg aat att gaa ctg gaa gca gca 1494Asp Glu Ile Arg Lys Asn Ala Gln Leu Asn Ile Glu Leu Glu Ala Ala 475 480 485 cat cat taggctttat gactgggtgt gtgttgtgtg tatgtaatac ataatgttta 1550His His 490 ttgtacagat gtgtggggtt tgtgttttat gatacattac agccaaatta tttgttggtt 1610tatggacata ctgccctttc attttttttc ttttccagtg tttaggtgat ctcaaattag 1670gaaatgcatt taaccatgta aaagatgagt gctaaagtaa gctttttagg gccctttgcc 1730aataggtagt cattcaatct ggtattgatc ttttcacaaa taacagaact gagaaacttt 1790tatatataac tgatgatcac ataaaacaga tttgcataaa attaccatga ttgctttatg 1850tttatattta acttgtattt ttgtacaaac aagattgtgt aagatatatt tgaagtttca 1910gtgatttaac agtctttcca acttttcatg atttttatga gcacagactt tcaagaaaat 1970acttgaaaat aaattacatt gccttttgtc cattaatcag caaataaaac atggccttaa 2030caaagttgtt tgtgttattg tacaatttga aaattatgtc gggacatacc ctatagaatt 2090actaacctta ctgccccttg tagaatatgt attaatcatt ctacattaaa gaaaataatg 2150gttcttactg gaatgtctag gcactgtaca gttattatat atcttggttg ttgtattgta 2210ccagtgaaat gccaaatttg aaaggcctgt actgcaattt tatatgtcag agattgcctg 2270tggctctaat atgcacctca agattttaag gagataatgt ttttagagag aatttctgct 2330tccactatag aatatataca taaatgtaaa atacttacaa aagtgg 2376 <210>2 <211>2385 <212>DNA <213>Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (79)..(1374) <400> 2 ggcccgcggg cctcgccgcc ccgcgcggat cgtcgcggcc cggccgtccc gtcccaggaa 60gtggccgtcc tgagcgcc atg gct cac tcc ccg gtg cag tcg ggc ctg ccc 111 Met Ala His Ser Pro Val Gln Ser Gly Leu Pro 1 5 10 ggc atg cag aac cta aag gca gac cca gaa gag ctt ttt aca aaa cta 159Gly Met Gln Asn Leu Lys Ala Asp Pro Glu Glu Leu Phe Thr Lys Leu 15 20 25 gag aaa att ggg aag ggc tcc ttt gga gag gtg ttc aaa ggc att gac 207Glu Lys Ile Gly Lys Gly Ser Phe Gly Glu Val Phe Lys Gly Ile Asp 30 35 40 aat cgg act cag aaa gtg gtt gcc ata aag atc att gat ctg gaa gaa 255Asn Arg Thr Gln Lys Val Val Ala Ile Lys Ile Ile Asp Leu Glu Glu 45 50 55 gct gaa gat gag ata gag gac att caa caa gaa atc aca gtg ctg agt 303Ala Glu Asp Glu Ile Glu Asp Ile Gln Gln Glu Ile Thr Val Leu Ser 60 65 70 75 cag tgt gac agt cca tat gta acc aaa tat tat gga tcc tat ctg aag 351Gln Cys Asp Ser Pro Tyr Val Thr Lys Tyr Tyr Gly Ser Tyr Leu Lys 80 85 90 gat aca aaa tta tgg ata ata atg gaa tat ctt ggt gga ggc tcc gca 399Asp Thr Lys Leu Trp Ile Ile Met Glu Tyr Leu Gly Gly Gly Ser Ala 95 100 105 cta gat cta tta gaa cct ggc cca tta gat gaa acc cag atc gct act 447Leu Asp Leu Leu Glu Pro Gly Pro Leu Asp Glu Thr Gln Ile Ala Thr 110 115 120 ata tta aga gaa ata ctg aaa gga ctc gat tat ctc cat tcg gag aag 495Ile Leu Arg Glu Ile Leu Lys Gly Leu Asp Tyr Leu His Ser Glu Lys 125 130 135 aaa atc cac aga gac att aaa gcg gcc aac gtc ctg ctg tct gag cat 543Lys Ile His Arg Asp Ile Lys Ala Ala Asn Val Leu Leu Ser Glu His 140 145 150 155 ggc gag gtg aag ctg gcg gac ttt ggc gtg gct ggc cag ctg aca gac 591Gly Glu Val Lys Leu Ala Asp Phe Gly Val Ala Gly Gln Leu Thr Asp 160 165 170 acc cag atc aaa agg aac acc ttc gtg ggc acc cca ttc tgg atg gca 639Thr Gln Ile Lys Arg Asn Thr Phe Val Gly Thr Pro Phe Trp Met Ala 175 180 185 ccc gag gtc atc aaa cag tcg gcc tat gac tcg aag gca gac atc tgg 687Pro Glu Val Ile Lys Gln Ser Ala Tyr Asp Ser Lys Ala Asp Ile Trp 190 195 200 tcc ctg ggc ata aca gct att gaa ctt gca aga ggg gaa cca cct cat 735Ser Leu Gly Ile Thr Ala Ile Glu Leu Ala Arg Gly Glu Pro Pro His 205 210 215 tcc gag ctg cac ccc atg aaa gtt tta ttc ctc att cca aag aac aac 783Ser Glu Leu His Pro Met Lys Val Leu Phe Leu Ile Pro Lys Asn Asn 220 225 230 235 cca ccg acg ttg gaa gga aac tac agt aaa ccs ctc aag gag ttt gtg 831Pro Pro Thr Leu Glu Gly Asn Tyr Ser Lys Xaa Leu Lys Glu Phe Val 240 245 250 gag gcc tgt ttg aat aag gag ccg agc ttt aga ccc act gct aag gag 879Glu Ala Cys Leu Asn Lys Glu Pro Ser Phe Arg Pro Thr Ala Lys Glu 255 260 265 tta ttg aag cac aag ttt ata cta cgc aat gca aag aaa act tcc tac 927Leu Leu Lys His Lys Phe Ile Leu Arg Asn Ala Lys Lys Thr Ser Tyr 270 275 280 ttg acc gag ctc atc gac agg tac aag aga tgg aag gcc gag cag agc 975Leu Thr Glu Leu Ile Asp Arg Tyr Lys Arg Trp Lys Ala Glu Gln Ser 285 290 295 cat gac gac tcg agc tcc gag gat tcc gac gcg gaa aca gat ggc caa 1023His Asp Asp Ser Ser Ser Glu Asp Ser Asp Ala Glu Thr Asp Gly Gln 300 305 310 315 gcc tcg ggg ggc agt gat tct ggg gac tgg atc ttc aca atc cga gaa 1071Ala Ser Gly Gly Ser Asp Ser Gly Asp Trp Ile Phe Thr Ile Arg Glu 320 325 330 aaa gat ccc aag aat ctc gag aat gga gct ctt cag cca tcg gac ttg 1119Lys Asp Pro Lys Asn Leu Glu Asn Gly Ala Leu Gln Pro Ser Asp Leu 335 340 345 gac aga aat aag atg aaa gac atc cca aag agg cct ttc tct cag tgt 1167Asp Arg Asn Lys Met Lys Asp Ile Pro Lys Arg Pro Phe Ser Gln Cys 350 355 360 tta tct aca att att tct cct ctg ttt gca gag ttg aag gag aag agc 1215Leu Ser Thr Ile Ile Ser Pro Leu Phe Ala Glu Leu Lys Glu Lys Ser 365 370 375 cag gcg tgc gga ggg aac ttg ggt tcc att gaa gag ctg cga ggg gcc 1263Gln Ala Cys Gly Gly Asn Leu Gly Ser Ile Glu Glu Leu Arg Gly Ala 380 385 390 395 atc tac cta gcg gag gag gtg tgc cct ggc atc tcc gac acc atg gtg 1311Ile Tyr Leu Ala Glu Glu Val Cys Pro Gly Ile Ser Asp Thr Met Val 400 405 410 gcc cag ctc gtg cag cgg ctc cag aga tac tct cta agt ggt gga gga 1359Ala Gln Leu Val Gln Arg Leu Gln Arg Tyr Ser Leu Ser Gly Gly Gly 415 420 425 act tca tcc cac tga aattcctttg gcatttgggg ttttgttttt ccttttttcc 1414Thr Ser Ser His 430 ttcttcatcc tcctcctttt ttaaaagtca acgagagcct tcgctgactc caccgaagag 1474gtgcgccact gggagccacc ccagcsccag gcgcccgtcc agggacacac acagtcttcg 1534ctgtgctgca gccagatgaa gtctctcaga tgggtgggga gggtcagctc cttccagcga 1594tcattttatt ttattttatt acttttgttt ttaattttaa ccatagcgca catattccag 1654gaaagtgtct ttaaaaacaa aaacaaaccc tgaaatgtat atttgggatt atgataaggc 1714aactaaagac atgaaacctc aggtatcctg ctttaagttg ataactccct ctgggagctg 1774gagaatcgct ctggtggatg ggtgtacaga tttgtatata atgtcatttt tacggaaacc 1834ctttcggcgt gcataaggaa tcactgtgta caaactggcc aagtgcttct gtagataacg 1894tcagtggagt aaatattcga caggccataa cttgagtcta ttgccttgcc tttattacat 1954gtacattttg aattctgtga ccagtgattt gggttttatt ttgtatttgc agggtttgtc 2014attaataatt aatgcccctc tcttacagaa cactcctatt tgtacctcaa caaatgcaaa 2074ttttccccgt ttgccctacg ccccttttgg tacacctaga ggttgatttc ctttttcatc 2134gatggtacta tttcttagtg ttttaaattg gaacatatct tgcctcatga agctttaaat 2194tataattttc agtttctccc catgaagcgc tctcgtctga catttgtttg gaatcgtgcc 2254actgctggtc tgcgccagat gtaccgtcct ttccaatacg attttctgtt gcaccttgta 2314gtggattctg catatcatct ttcccaccta aaaatgtctg aatgcttaca caaataaatt 2374ttataacacg c 2385【0022】
<210> 3 <211> 6597 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (95)..(6367) <400> 3 aggggaggaa gtttgctgtc gagcggcctg ggttccgtgg gcaaggcgtg ggtggcagcg 60ttggctcgtt cgacgacaca ctgagggcgg cgcg atg gga gac gag atg gat gcc 115 Met Gly Asp Glu Met Asp Ala 1 5 atg att ccc gag cgg gag atg aag gat ttt cag ttt aga gcg cta aag 163Met Ile Pro Glu Arg Glu Met Lys Asp Phe Gln Phe Arg Ala Leu Lys 10 15 20 aag gtg aga atc ttt gac tcc cct gag gaa ttg ccc aag gaa cgc tcg 211Lys Val Arg Ile Phe Asp Ser Pro Glu Glu Leu Pro Lys Glu Arg Ser 25 30 35 agt ctg ctt gct gtg tcc aac aaa tat ggt ctg gtc ttc gct ggt gga 259Ser Leu Leu Ala Val Ser Asn Lys Tyr Gly Leu Val Phe Ala Gly Gly 40 45 50 55 gcc agt ggc ttg cag att ttt cct act aaa aat ctt ctt att caa aat 307Ala Ser Gly Leu Gln Ile Phe Pro Thr Lys Asn Leu Leu Ile Gln Asn 60 65 70 aaa ccc gga gat gat ccc aac aaa ata gtt gat aaa gtc caa ggc ttg 355Lys Pro Gly Asp Asp Pro Asn Lys Ile Val Asp Lys Val Gln Gly Leu 75 80 85 cta gtt cct atg aaa ttc cca atc cat cac ctg gcc ttg agc tgt gat 403Leu Val Pro Met Lys Phe Pro Ile His His Leu Ala Leu Ser Cys Asp 90 95 100 aac ctc aca ctc tct gcg tgc atg atg tcc agt gaa tat ggt tcc att 451Asn Leu Thr Leu Ser Ala Cys Met Met Ser Ser Glu Tyr Gly Ser Ile 105 110 115 att gct ttt ttt gat gtt cgc aca ttc tca aat gag gct aaa cag caa 499Ile Ala Phe Phe Asp Val Arg Thr Phe Ser Asn Glu Ala Lys Gln Gln 120 125 130 135 aaa cgc cca ttt gcc tat cat aag ctt ttg aaa gat gca gca ggc atg 547Lys Arg Pro Phe Ala Tyr His Lys Leu Leu Lys Asp Ala Ala Gly Met 140 145 150 gtg att gat atg aag tgg aac ccc act gtc ccc tcc atg gtg gca gtt 595Val Ile Asp Met Lys Trp Asn Pro Thr Val Pro Ser Met Val Ala Val 155 160 165 tgt ctg gct gat ggt agt att gat gtc ctg caa gtc acg gaa aca gtg 643Cys Leu Ala Asp Gly Ser Ile Asp Val Leu Gln Val Thr Glu Thr Val 170 175 180 aaa gta tgt gca act ctt cct tcc acg gta gca gta acc tct gtg tgc 691Lys Val Cys Ala Thr Leu Pro Ser Thr Val Ala Val Thr Ser Val Cys 185 190 195 tgg agc ccc aaa gga aag cag ctg gca gtg gga aaa cag aat gga act 739Trp Ser Pro Lys Gly Lys Gln Leu Ala Val Gly Lys Gln Asn Gly Thr 200 205 210 215 gtg gtc cag tat ctt cct act ttg cag gaa aaa aaa gtc att cct tgt 787Val Val Gln Tyr Leu Pro Thr Leu Gln Glu Lys Lys Val Ile Pro Cys 220 225 230 cct ccg ttt tat gag tca gat cat cct gtc aga gtt ctg gat gtg ctg 835Pro Pro Phe Tyr Glu Ser Asp His Pro Val Arg Val Leu Asp Val Leu 235 240 245 tgg att ggt acc tac gtc ttc gcc ata gtg tat gct gct gca gat ggg 883Trp Ile Gly Thr Tyr Val Phe Ala Ile Val Tyr Ala Ala Ala Asp Gly 250 255 260 acc ctg gaa acg tct cca gat gtg gtg atg gct cta cta ccg aaa aaa 931Thr Leu Glu Thr Ser Pro Asp Val Val Met Ala Leu Leu Pro Lys Lys 265 270 275 gaa gaa aag cac cca gag ata ttt gtg aac ttt atg gag ccc tgt tat 979Glu Glu Lys His Pro Glu Ile Phe Val Asn Phe Met Glu Pro Cys Tyr 280 285 290 295 ggc agc tgc acg gag aga cag cat cat tac tac ctc agt tac att gag 1027Gly Ser Cys Thr Glu Arg Gln His His Tyr Tyr Leu Ser Tyr Ile Glu 300 305 310 gaa tgg gat tta gtg ctg gca gca tct gcg gct tca aca gaa gtt agt 1075Glu Trp Asp Leu Val Leu Ala Ala Ser Ala Ala Ser Thr Glu Val Ser 315 320 325 atc ctt gct cga caa agt gat cag att aat tgg gaa tct tgg cta ctg 1123Ile Leu Ala Arg Gln Ser Asp Gln Ile Asn Trp Glu Ser Trp Leu Leu 330 335 340 gag gat tct agt cga gct gaa ttg cct gtg aca gac aag agt gat gac 1171Glu Asp Ser Ser Arg Ala Glu Leu Pro Val Thr Asp Lys Ser Asp Asp 345 350 355 tcc ttg ccc atg gga gtt gtc gta gac tat aca aac caa gtg gaa atc 1219Ser Leu Pro Met Gly Val Val Val Asp Tyr Thr Asn Gln Val Glu Ile 360 365 370 375 acc atc agt gat gaa aag act ctt cct cct gct cca gtt ctc atg tta 1267Thr Ile Ser Asp Glu Lys Thr Leu Pro Pro Ala Pro Val Leu Met Leu 380 385 390 ctt tca aca gat ggt gtg ctt tgt cca ttt tat atg att aat caa aat 1315Leu Ser Thr Asp Gly Val Leu Cys Pro Phe Tyr Met Ile Asn Gln Asn 395 400 405 cct ggg gtt aag tct ctc atc aaa aca cca gag cga ctt tca tta gaa 1363Pro Gly Val Lys Ser Leu Ile Lys Thr Pro Glu Arg Leu Ser Leu Glu 410 415 420 gga gag cga cag ccc aag tca cca gga agt act ccc act acc cca acc 1411Gly Glu Arg Gln Pro Lys Ser Pro Gly Ser Thr Pro Thr Thr Pro Thr 425 430 435 tcc tct caa gcc cca cag aaa ctg gat gct tct gca gct gca gcc cct 1459Ser Ser Gln Ala Pro Gln Lys Leu Asp Ala Ser Ala Ala Ala Ala Pro 440 445 450 455 gcc tct ctg cca cct tca tca cct gct gct ccc att gcc act ttt tct 1507Ala Ser Leu Pro Pro Ser Ser Pro Ala Ala Pro Ile Ala Thr Phe Ser 460 465 470 ttg ctt cct gct ggt gga gcc ccc act gtg ttc tcc ttt ggt tct tca 1555Leu Leu Pro Ala Gly Gly Ala Pro Thr Val Phe Ser Phe Gly Ser Ser 475 480 485 tct ttg aag tca tct gct acg gtc act ggg gag ccc cct tca tat tcc 1603Ser Leu Lys Ser Ser Ala Thr Val Thr Gly Glu Pro Pro Ser Tyr Ser 490 495 500 agt ggc tcc gac agc tcc aaa gca gcc cca ggc cct ggc cca tca acc 1651Ser Gly Ser Asp Ser Ser Lys Ala Ala Pro Gly Pro Gly Pro Ser Thr 505 510 515 ttc tct ttt gtt ccc cct tct aaa gcc tcc cta gcc ccc acc cct gca 1699Phe Ser Phe Val Pro Pro Ser Lys Ala Ser Leu Ala Pro Thr Pro Ala 520 525 530 535 gcg tct cct gtg gct cca tca gct gct tca ttc tcc ttt gga tca tct 1747Ala Ser Pro Val Ala Pro Ser Ala Ala Ser Phe Ser Phe Gly Ser Ser 540 545 550 ggt ttt aag cct acc ctg gaa agc aca cca gtg cca agt gtg tct gct 1795Gly Phe Lys Pro Thr Leu Glu Ser Thr Pro Val Pro Ser Val Ser Ala 555 560 565 cca aat ata gca atg aag tcc tcc ttc cca ccc tca acc tct gct gtc 1843Pro Asn Ile Ala Met Lys Ser Ser Phe Pro Pro Ser Thr Ser Ala Val 570 575 580 aaa gtc aac ctt agt gaa aag ttt act gct gca gct acc tct act cct 1891Lys Val Asn Leu Ser Glu Lys Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ser Thr Pro 585 590 595 gtt agt agc tcc cag agc gca ccc ccg atg tcg cca ttc tct tct gcc 1939Val Ser Ser Ser Gln Ser Ala Pro Pro Met Ser Pro Phe Ser Ser Ala 600 605 610 615 tcc aag cca gct gct tct gga cca ctc agc cac ccc acg cct ctc tca 1987Ser Lys Pro Ala Ala Ser Gly Pro Leu Ser His Pro Thr Pro Leu Ser 620 625 630 gca cca cct agt tcc gtg cca ttg aag tcc tca gtc ttg ccc tca cca 2035Ala Pro Pro Ser Ser Val Pro Leu Lys Ser Ser Val Leu Pro Ser Pro 635 640 645 tca gga cga tct gct cag ggc agt tca agc cca gtg ccc tca atg gta 2083Ser Gly Arg Ser Ala Gln Gly Ser Ser Ser Pro Val Pro Ser Met Val 650 655 660 cag aaa tca ccc agg ata acc cct cca gcg gca aag cca ggc tct ccc 2131Gln Lys Ser Pro Arg Ile Thr Pro Pro Ala Ala Lys Pro Gly Ser Pro 665 670 675 cag gca aag tca ctt cag cct gct gtt gca gaa aag cag gga cat cag 2179Gln Ala Lys Ser Leu Gln Pro Ala Val Ala Glu Lys Gln Gly His Gln 680 685 690 695 tgg aaa gat tca gat cct gta atg gct gga att ggg gag gag att gca 2227Trp Lys Asp Ser Asp Pro Val Met Ala Gly Ile Gly Glu Glu Ile Ala 700 705 710 cac ttt cag aag gag ttg gaa gag tta aaa gcc cga act tcc aaa gcc 2275His Phe Gln Lys Glu Leu Glu Glu Leu Lys Ala Arg Thr Ser Lys Ala 715 720 725 tgt ttc caa gtg ggc act tct gag gag atg aag atg ctg cga aca gaa 2323Cys Phe Gln Val Gly Thr Ser Glu Glu Met Lys Met Leu Arg Thr Glu 730 735 740 tca gat gac ttg cat acc ttt ctt ttg gag att aaa gag acc aca gag 2371Ser Asp Asp Leu His Thr Phe Leu Leu Glu Ile Lys Glu Thr Thr Glu 745 750 755 tcg ctt cat gga gat ata agt agc ctg aaa aca act tta ctt gag ggc 2419Ser Leu His Gly Asp Ile Ser Ser Leu Lys Thr Thr Leu Leu Glu Gly 760 765 770 775 ttt gct ggt gtt gag gaa gcc aga gaa caa aat gaa aga aat cgt gac 2467Phe Ala Gly Val Glu Glu Ala Arg Glu Gln Asn Glu Arg Asn Arg Asp 780 785 790 tct ggt tat ctg cat ttg ctt tat aaa aga cca ctg gat ccc aag agt 2515Ser Gly Tyr Leu His Leu Leu Tyr Lys Arg Pro Leu Asp Pro Lys Ser 795 800 805 gaa gct cag ctt cag gaa att cgg cgc ctt cat cag tat gtg aaa ttt 2563Glu Ala Gln Leu Gln Glu Ile Arg Arg Leu His Gln Tyr Val Lys Phe 810 815 820 gct gtc caa gat gtg aat gat gtt cta gac ttg gag tgg gat cag cat 2611Ala Val Gln Asp Val Asn Asp Val Leu Asp Leu Glu Trp Asp Gln His 825 830 835 ctg gaa caa aag aaa aaa caa agg cac ctg ctt gtg cca gag cga gag 2659Leu Glu Gln Lys Lys Lys Gln Arg His Leu Leu Val Pro Glu Arg Glu 840 845 850 855 aca ctg ttt aac acc cta gcc aac aat cgg gaa atc atc aac caa cag 2707Thr Leu Phe Asn Thr Leu Ala Asn Asn Arg Glu Ile Ile Asn Gln Gln 860 865 870 agg aag agg ctg aat cac ctg gtg gat agt ctt cag cag ctc cgc ctt 2755Arg Lys Arg Leu Asn His Leu Val Asp Ser Leu Gln Gln Leu Arg Leu 875 880 885 tac aaa cag act tcc ctg tgg agc ctg tcc tcg gct gtt cct tcc cag 2803Tyr Lys Gln Thr Ser Leu Trp Ser Leu Ser Ser Ala Val Pro Ser Gln 890 895 900 agc agc att cac agt ttt gac agt gac ctg gaa agc ctg tgc aat gct 2851Ser Ser Ile His Ser Phe Asp Ser Asp Leu Glu Ser Leu Cys Asn Ala 905 910 915 ttg ttg aaa acc acc ata gaa tct cac acc aaa tcc ttg ccc aaa gta 2899Leu Leu Lys Thr Thr Ile Glu Ser His Thr Lys Ser Leu Pro Lys Val 920 925 930 935 cca gcc aaa ctg tcc ccc atg aaa cag gca caa ctg aga aac ttc ttg 2947Pro Ala Lys Leu Ser Pro Met Lys Gln Ala Gln Leu Arg Asn Phe Leu 940 945 950 gcc aag agg aag acc cca cca gtg aga tcc act gct cca gcc agc ctg 2995Ala Lys Arg Lys Thr Pro Pro Val Arg Ser Thr Ala Pro Ala Ser Leu 955 960 965 tct cga tca gcc ttt ctg tct cag aga tat tat gaa gac ttg gat gaa 3043Ser Arg Ser Ala Phe Leu Ser Gln Arg Tyr Tyr Glu Asp Leu Asp Glu 970 975 980 gtc agc tca acg tca tct gtc tcc cag tct ctg gag agt gaa gat gca 3091Val Ser Ser Thr Ser Ser Val Ser Gln Ser Leu Glu Ser Glu Asp Ala 985 990 995 cgg acg tcc tgt aaa gat gac gag gca gtg gtt cag gcc cct cgg cac 3139Arg Thr Ser Cys Lys Asp Asp Glu Ala Val Val Gln Ala Pro Arg His 1000 1005 1010 1015 gcc ccc gtg gtt cgc act cct tcc atc cag ccc agt ctc ttg ccc cat 3187Ala Pro Val Val Arg Thr Pro Ser Ile Gln Pro Ser Leu Leu Pro His 1020 1025 1030 gca gca cct ttt gct aaa tct cac ctg gtt cat ggt tct tca cct ggt 3235Ala Ala Pro Phe Ala Lys Ser His Leu Val His Gly Ser Ser Pro Gly 1035 1040 1045 gtg atg gga act tca gtg gct aca tct gct agc aaa att att cct caa 3283Val Met Gly Thr Ser Val Ala Thr Ser Ala Ser Lys Ile Ile Pro Gln 1050 1055 1060 ggg gcc gat agc aca atg ctt gcc acg aaa acc gtg aaa cat ggt gca 3331Gly Ala Asp Ser Thr Met Leu Ala Thr Lys Thr Val Lys His Gly Ala 1065 1070 1075 cct agt cct tcc cac ccc atc tca gcc ccg cag cag ctg gcc gca gca 3379Pro Ser Pro Ser His Pro Ile Ser Ala Pro Gln Gln Leu Ala Ala Ala 1080 1085 1090 1095 gca ctc agg cgg cag atg gcc agt cag gca cca gct gta aac act ttg 3427Ala Leu Arg Arg Gln Met Ala Ser Gln Ala Pro Ala Val Asn Thr Leu 1100 1105 1110 act gaa tca acg ttg aag aat gtc cct caa gtg gta aat gtg cag gaa 3475Thr Glu Ser Thr Leu Lys Asn Val Pro Gln Val Val Asn Val Gln Glu 1115 1120 1125 ttg aag aat aac cct gca acc cct tct aca gcc atg ggt tct tca gtg 3523Leu Lys Asn Asn Pro Ala Thr Pro Ser Thr Ala Met Gly Ser Ser Val 1130 1135 1140 ccc tac tcc aca gcc aaa aca cct cac cca gtg ttg acc cca gtg gct 3571Pro Tyr Ser Thr Ala Lys Thr Pro His Pro Val Leu Thr Pro Val Ala 1145 1150 1155 gct aac caa gcc aag cag ggg tct cta ata aat tcc ctt aag cca tct 3619Ala Asn Gln Ala Lys Gln Gly Ser Leu Ile Asn Ser Leu Lys Pro Ser 1160 1165 1170 1175 ggg cct aca cca gca tcc ggt cag tta tca tct ggt gac aaa gct tca 3667Gly Pro Thr Pro Ala Ser Gly Gln Leu Ser Ser Gly Asp Lys Ala Ser 1180 1185 1190 ggg aca gcc aag ata gaa aca gct gtg act tca acc cca tct gct tct 3715Gly Thr Ala Lys Ile Glu Thr Ala Val Thr Ser Thr Pro Ser Ala Ser 1195 1200 1205 ggg cag ttc agc aag cct ttc tca ttt tct cca tca ggg act ggc ttt 3763Gly Gln Phe Ser Lys Pro Phe Ser Phe Ser Pro Ser Gly Thr Gly Phe 1210 1215 1220 aat ttt ggg ata atc aca cca aca ccg tct tct aat ttc act gct gca 3811Asn Phe Gly Ile Ile Thr Pro Thr Pro Ser Ser Asn Phe Thr Ala Ala 1225 1230 1235 caa ggg gca aca ccc tcc act aaa gag tca agc cag ccg gac gca ttc 3859Gln Gly Ala Thr Pro Ser Thr Lys Glu Ser Ser Gln Pro Asp Ala Phe 1240 1245 1250 1255 tca tct ggt ggg gga agc aaa cct tct tat gag gcc att cct gaa agc 3907Ser Ser Gly Gly Gly Ser Lys Pro Ser Tyr Glu Ala Ile Pro Glu Ser 1260 1265 1270 tca cct ccc tca gga atc aca tcc gca tca aac acc acc cca gga gaa 3955Ser Pro Pro Ser Gly Ile Thr Ser Ala Ser Asn Thr Thr Pro Gly Glu 1275 1280 1285 cct gcc gca tct agc agc aga cct gtg gca cct tct gga act gct ctt 4003Pro Ala Ala Ser Ser Ser Arg Pro Val Ala Pro Ser Gly Thr Ala Leu 1290 1295 1300 tcc acc acc tct agt aag ctg gaa acc cca ccg tcc aag ctg gga gag 4051Ser Thr Thr Ser Ser Lys Leu Glu Thr Pro Pro Ser Lys Leu Gly Glu 1305 1310 1315 ctt ctg ttt cca agt tct ttg gct gga gag act ctg gga agt ttt tca 4099Leu Leu Phe Pro Ser Ser Leu Ala Gly Glu Thr Leu Gly Ser Phe Ser 1320 1325 1330 1335 gga ctg cgg gtt ggc caa gca gat gat tct aca aaa cca acc aat aag 4147Gly Leu Arg Val Gly Gln Ala Asp Asp Ser Thr Lys Pro Thr Asn Lys 1340 1345 1350 gct tca tcc aca agc cta act agt acc cag cca acc aag acg tca ggc 4195Ala Ser Ser Thr Ser Leu Thr Ser Thr Gln Pro Thr Lys Thr Ser Gly 1355 1360 1365 gtg ccc tca ggg ttt aat ttt act gcc ccc ccg gtg tta ggg aag cac 4243Val Pro Ser Gly Phe Asn Phe Thr Ala Pro Pro Val Leu Gly Lys His 1370 1375 1380 acg gag ccc cct gtg aca tcc tct gca acc acc acc tca gta gca cca 4291Thr Glu Pro Pro Val Thr Ser Ser Ala Thr Thr Thr Ser Val Ala Pro 1385 1390 1395 cca gca gcc acc agc act tcc tca act gcc gtt ttt ggc agt ctg cca 4339Pro Ala Ala Thr Ser Thr Ser Ser Thr Ala Val Phe Gly Ser Leu Pro 1400 1405 1410 1415 gtc acc agt gca gga tcc tct ggg gtc atc agt ttt ggt ggg aca tct 4387Val Thr Ser Ala Gly Ser Ser Gly Val Ile Ser Phe Gly Gly Thr Ser 1420 1425 1430 cta agt gct ggc aag act agt ttt tca ttt gga agc caa cag acc aat 4435Leu Ser Ala Gly Lys Thr Ser Phe Ser Phe Gly Ser Gln Gln Thr Asn 1435 1440 1445 agc aca gtg ccc cca tct gcc cca cca cca act aca gct gcc act ccc 4483Ser Thr Val Pro Pro Ser Ala Pro Pro Pro Thr Thr Ala Ala Thr Pro 1450 1455 1460 ctt cca aca tca ttc ccc aca ttg tca ttt ggt agc ctc ctg agt tca 4531Leu Pro Thr Ser Phe Pro Thr Leu Ser Phe Gly Ser Leu Leu Ser Ser 1465 1470 1475 gca act acc ccc tcc ctg cct atg tcc gct ggc aga agc aca gaa gag 4579Ala Thr Thr Pro Ser Leu Pro Met Ser Ala Gly Arg Ser Thr Glu Glu 1480 1485 1490 1495 gcc act tca tca gct ttg cct gag aag cca ggt gac agt gag gtc tca 4627Ala Thr Ser Ser Ala Leu Pro Glu Lys Pro Gly Asp Ser Glu Val Ser 1500 1505 1510 gca tca gca gcc tca ctt cta gag gag caa cag tca gcc cag ctt ccc 4675Ala Ser Ala Ala Ser Leu Leu Glu Glu Gln Gln Ser Ala Gln Leu Pro 1515 1520 1525 cag gct cct ccg caa act tct gac tct gtt aaa aaa gaa cct gtt ctt 4723Gln Ala Pro Pro Gln Thr Ser Asp Ser Val Lys Lys Glu Pro Val Leu 1530 1535 1540 gcc cag cct gca gtc agc aac tct ggc act gca gca tct agt act agt 4771Ala Gln Pro Ala Val Ser Asn Ser Gly Thr Ala Ala Ser Ser Thr Ser 1545 1550 1555 ctt gta gca ctt tct gca gag gct acc cca gcc acc acg ggg gtc cct 4819Leu Val Ala Leu Ser Ala Glu Ala Thr Pro Ala Thr Thr Gly Val Pro 1560 1565 1570 1575 gat gcc agg acg gag gca gta cca cct gct tcc tcc ttt tct gtg cct 4867Asp Ala Arg Thr Glu Ala Val Pro Pro Ala Ser Ser Phe Ser Val Pro 1580 1585 1590 ggg cag act gct gtc aca gca gct gct atc tca agt gca ggc cct gtg 4915Gly Gln Thr Ala Val Thr Ala Ala Ala Ile Ser Ser Ala Gly Pro Val 1595 1600 1605 gcc gtc gaa aca tca agt acc ccc ata gcc tcc agc acc acg tcc att 4963Ala Val Glu Thr Ser Ser Thr Pro Ile Ala Ser Ser Thr Thr Ser Ile 1610 1615 1620 gtt gct ccc ggc cca tct gca gag gca gca gca ttt ggt acc gtc act 5011Val Ala Pro Gly Pro Ser Ala Glu Ala Ala Ala Phe Gly Thr Val Thr 1625 1630 1635 tct ggc tca tcc gtc ttt gct cag cct cct gct gcc agt tct agc tca 5059Ser Gly Ser Ser Val Phe Ala Gln Pro Pro Ala Ala Ser Ser Ser Ser 1640 1645 1650 1655 gct ttc aac cag ctc acc aac aac aca gcc act gcc ccc tct gcc acg 5107Ala Phe Asn Gln Leu Thr Asn Asn Thr Ala Thr Ala Pro Ser Ala Thr 1660 1665 1670 ccc gtg ttt ggg caa gtg gca gcc agc acc gca cca agt ctg ttt ggg 5155Pro Val Phe Gly Gln Val Ala Ala Ser Thr Ala Pro Ser Leu Phe Gly 1675 1680 1685 cag cag act ggt agc aca gcc agc aca gca gct gcc aca cca cag gtc 5203Gln Gln Thr Gly Ser Thr Ala Ser Thr Ala Ala Ala Thr Pro Gln Val 1690 1695 1700 agc agc tca ggg ttt agc agc cca gct ttt ggt acc aca gcc cca ggg 5251Ser Ser Ser Gly Phe Ser Ser Pro Ala Phe Gly Thr Thr Ala Pro Gly 1705 1710 1715 gtc ttt gga cag aca acc ttc ggg cag gcc tca gtc ttt ggg cag tcg 5299Val Phe Gly Gln Thr Thr Phe Gly Gln Ala Ser Val Phe Gly Gln Ser 1720 1725 1730 1735 gcg agc agt gct gca agt gtc ttt tcc ttc agt cag cct ggg ttc agt 5347Ala Ser Ser Ala Ala Ser Val Phe Ser Phe Ser Gln Pro Gly Phe Ser 1740 1745 1750 tcc gtg cct gcc ttc ggt cag cct gct tcc tcc act ccc aca tcc acc 5395Ser Val Pro Ala Phe Gly Gln Pro Ala Ser Ser Thr Pro Thr Ser Thr 1755 1760 1765 agt gga agt gtc ttt ggt gcc gcc tca agt acc agt agc tcc agt tcc 5443Ser Gly Ser Val Phe Gly Ala Ala Ser Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser 1770 1775 1780 ttc tca ttt gga cag tct tct ccc aac aca gga ggg ggg ctg ttt ggc 5491Phe Ser Phe Gly Gln Ser Ser Pro Asn Thr Gly Gly Gly Leu Phe Gly 1785 1790 1795 caa agc aac gct cct gct ttt ggg cag agt cct ggc ttt gga cag gga 5539Gln Ser Asn Ala Pro Ala Phe Gly Gln Ser Pro Gly Phe Gly Gln Gly 1800 1805 1810 1815 ggc tct gtc ttt ggt ggt acc tca gct gcc acc aca aca gca gca acc 5587Gly Ser Val Phe Gly Gly Thr Ser Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Thr 1820 1825 1830 tct ggg ttc agc ttt tgc caa gct tca ggt ttt ggg tct agt aat act 5635Ser Gly Phe Ser Phe 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cag agt agc gga ttc tct ggt ttt gga tca ggc aca gga 6307Phe Gly Thr Gln Ser Ser Gly Phe Ser Gly Phe Gly Ser Gly Thr Gly 2060 2065 2070 ggg ttc agc ttt ggg tca aat aac tcg tct gtc cag ggt ttt ggt ggc 6355Gly Phe Ser Phe Gly Ser Asn Asn Ser Ser Val Gln Gly Phe Gly Gly 2075 2080 2085 tgg cga agc tga gggcgtgtca gcaggccttt cgatccctgg gaccaaccgc 6407Trp Arg Ser 2090 atcctcagct tcttccccga gaaatgctgg agcaggctgt tcagaccgac gttgccatca 6467aaacacatac acccagaaag aaacaacaga aaccaaaact cacaaggcgc atgattactt 6527gttttatatt tcatgttggg ttttccctcc cactattaaa cagtctgttt ccgtacaaaa 6587aaaaaaaaaa 6597【0023】
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