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発明の名称 1,5−アンヒドログルシトールの酸化物およびそれを用いる1,5−アンヒドログルシトールの測定方法
発行国 日本国特許庁(JP)
公報種別 公開特許公報(A)
公開番号 特開平8−217773
公開日 平成8年(1996)8月27日
出願番号 特願平7−53673
出願日 平成7年(1995)2月17日
代理人 【弁理士】
【氏名又は名称】岡田 数彦
発明者 亀谷 俊一 / 赤沼 宏史
要約 目的
本発明は酸化酵素による1,5−アンヒドログルシトールの新規な酸化生成物および1,5−アンヒドログルシトールの精度よい測定方法を提供する。

構成
酸素の存在下、1,5−アンヒドログルシトールに酸化酵素であるピラノースオキシダーゼ又はL−ソルボースオキシダーゼとアルドース−2−ウロースデヒドラターゼを作用させて得られる2(S)−(ヒドロキシメチル)オキサン−4,5−ジオン、その水付加体またはそのオキシム誘導体。これらを定量することよりなる1,5−アンヒドログルシトールの精度よい測定方法。
特許請求の範囲
【請求項1】 下記の化学式[化1]で示される化学構造を有する2(S)−(ヒドロキシメチル)オキサン−4,5−ジオン、その水付加体またはそのオキシム誘導体。
【化1】

【請求項2】 そのオキシム誘導体がO−エチルオキシム誘導体である請求項1に記載の2(S)−(ヒドロキシメチル)オキサン−4,5−ジオンのオキシム誘導体。
【請求項3】 酸素の存在下、試料中の1,5−アンヒドログルシトールに1,5−アンヒドログルシトールの酸化酵素であるピラノースオキシダーゼ又はL−ソルボースオキシダーゼとアルドース−2−ウロースデヒドラターゼを作用させ、生成した2(S)−(ヒドロキシメチル)オキサン−4,5−ジオン又はその水付加体を必要によりその誘導体に変換させて定量することを特徴とする1,5−アンヒドログルシトールの測定方法。
【請求項4】 誘導体がO−エチルオキシム誘導体である請求項3に記載の測定方法。
発明の詳細な説明
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、1,5−アンヒドログルシトール(以下「1,5AG」という)の新規な構造を有する酸化物およびそれを用いる1,5AGの測定方法に関する。
【0002】
【従来の技術】1,5AGは、ヒト髄液及び血漿中などに存在し、ある種の疾患、特に糖尿病においては血漿中の量が低下することが報告されている化合物である。1,5AGを測定する方法は知られている(特開昭63−185397号公報)。この方法は、1,5AGをピラノースオキシダーゼ等で酸化して発生する過酸化水素を測定する方法である。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】本発明者等は、1,5AGについてピラノースオキシダーゼ等の酵素による酸化を詳細に検討した結果、1,5AGの新規な構造を有する酸化物が誘導され、この酸化物を定量することにより精度よく1,5AGを測定することができることを知見した。したがって、本発明の目的は、1,5AGの新規な構造を有する酸化物を提供するにある。また他の目的は、1,5AGの新規な構造を有する酸化物を用いる1,5AGの測定方法を提供するにある。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明の第一の要旨は、下記の化学式[化2](化1と同じ)で示される化学構造を有する2(S)−(ヒドロキシメチル)オキサン−4,5−ジオンと、その水付加体である下記の化学式[化3]で示される化学構造を有する2(S)−(ヒドロキシメチル)−4,4,5,5−テトラヒドロキシオキサンまたはそのオキシム誘導体に関する。
【0005】
【化2】

【0006】
【化3】

【0007】本発明の第二の要旨は、酸素の存在下、試料中の1,5AGにピラノースオキシダーゼ又はL−ソルボースオキシダーゼとアルドース−2−ウロースデヒドラターゼを作用させ、生成した上記の化学式[化2]で示される化学構造を有する2(S)−(ヒドロキシメチル)オキサン−4,5−ジオン又はその水付加体を必要によりその誘導体に変換させて定量することよりなる1,5AGの測定方法を提供するにある。
【0008】本発明につきさらに詳細に説明する。本発明で使用される試料としては髄液、血漿、血清、尿またはこれらから糖または蛋白などの測定を妨害する成分を除去して得られるもの等が挙げられる。
【0009】本発明で使用される1,5AGの酸化酵素であるピラノースオキシダーゼ又はL−ソルボースオキシダーゼは、国際生化学連合(IUB)酵素委員会の分類により、それぞれEC1.1.3.10又はEC1.1.3.11に分類されるものであれば何でもよく、これらの酵素の由来は問わない。
【0010】本発明で使用されるアルドース−2−ウロースデヒドラターゼ(aldos−2−ulose dehydratase)は公知のものが使用でき、たとえば、Carbohydrate Research,232,59−75(1992)に記載されているアルドース−2−ウロースデヒドラターゼが使用できる。
【0011】なお、ポリポラスオブツサス由来のピラノースオキシダーゼにはアルドース−2−ウロースデヒドラターゼを含んでいるものがある。例えば、宝酒造 (株 )製のピラノースオキシダーゼ「タカラ」にはこのアルドース−2−ウロースデヒドラターゼが含まれているので、このピラノースオキシダーゼを使用する場合には特にアルドース−2−ウロースデヒドラターゼを別途加える必要はない。
【0012】つぎに、本発明の2(S)−(ヒドロキシメチル)オキサン−4,5−ジオン又はその水付加体である2(S)−(ヒドロキシメチル)−4,4,5,5−テトラヒドロキシオキサンを製造する方法について述べる。これらの化合物は、1,5AGを酸化することにより得ることができ、1,5AGの酸化は、1,5AGを水または緩衝液に溶解した水溶液を、カタラーゼの存在下、ピラノースオキシダーゼ又はL−ソルボースオキシダーゼとアルドース−2−ウロースデヒドラターゼとに接触させることによって行われる。
【0013】接触の方法は、特に制限されない。例えば、酵素溶液としてこれらの酵素溶液を1,5AG水溶液に添加するか、酵素自体を架橋し又は高分子坦体に固定化して不溶化した酵素を、1,5AG水溶液に添加するか、前記の不溶化した酵素をカラムに充填(バイオリアクター)し、これに1,5AG水溶液を通液することにより行われる。
【0014】1,5AGの酸化反応の条件は、使用する酵素の性質によって変化するが、酵素が十分に作用しうるように緩衝液の種類と濃度、pH、反応温度、1,5AGの濃度、使用する酵素の量などを吟味し、選択すればよい。通常、酵素の至適条件の近傍に設定するのがより好ましい。
【0015】次に、1,5AGに前記の酵素を作用させたときに生じる生成物について述べる。
【0016】〔13C核磁気共鳴による方法〕化学的性質と生化学的性質が、1,5AGと同等であり、核磁気共鳴で構造を解析する上で都合のよい13C標識1,5AG(炭素骨格の全てを13C置換した1,5AG)を用い、酵素による反応の変化を13C核磁気共鳴スペクトルで追跡し、1,5AGの酸化反応生成物を推定する。
【0017】すなわち、13C標識1,5AG 8.5mg 、ピラノースオキシダーゼとアルドース−2−ウロースデヒドラターゼの混合物 (宝酒造( 株) 製、ピラノースオキシダーゼ「タカラ」)5mg、カタラーゼ (比活性 1,920U/mg) 1mg 、重水 0.1mlを50mM リン酸緩衝液 (pH 6.0) 0.5ml に溶解し、37℃で3時間反応させる。時間の経過とともに13C標識1,5AGは消失し、新たに13C標識化合物(A)が生成蓄積する。この物質の13C核磁気共鳴スペクトルを測定した。スペクトルの解析結果を表1と表2に示す。
【0018】この13C核磁気共鳴スペクトルの値から、13C標識化合物(A)の構造は、2(S)−(ヒドロキシメチル)オキサン−4,5−ジオン[化2]の水付加体である2(S)−(ヒドロキシメチル)−4,4,5,5−テトラヒドロキシオキサン[化3]と推定できる。
【0019】
【表1】

【0020】
【表2】

【0021】〔エチルオキシム誘導体による方法〕1,5AG 50mg 、ピラノースオキシダーゼとアルドース−2−ウロースデヒドラターゼの混合物 (宝酒造 (株 )製、ピラノースオキシダーゼ「タカラ」)5mg、カタラーゼ (比活性 1,920U/mg) 1mg を 50mMリン酸緩衝液 (pH 6.0) 2.0mlに溶解し、37℃で12時間反応する。
【0022】この反応液にO−エチルヒドロキシルアミン塩酸塩 300mgを添加後、酢酸ナトリウム水溶液を滴下して反応液の pH を約4とし、室温下でさらに12時間反応する。得られた反応液に酢酸エチルを加えて生成物を酢酸エチル層に抽出後、抽出液を減圧乾固する。この乾固した残渣を精製水で溶解後、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、約 35mg の化合物(B)の結晶を得る。この化合物(B)の結晶の物理化学的性状は、次の通りである。
【0023】
【表3】分子量: 230(理論値: 230.26 )
トリメチルシリル化した化合物(B)のマススペクトルによる。
分子式:C101824【0024】化合物(B)及び13C標識化合物(B)をトリメチルシリル化し、マススペクトル(EI−MSスペクトル)を測定した結果を表4に示す。親ピーク(M+)フラグメントの質量数から、化合物(B)の分子量を求め、分子式を推定した。
【0025】
【表4】

【0026】
【表5】紫外線吸収スペクトル:紫外線吸収スペクトルは、精製水に溶解して測定する。
最大吸収波長 259.6nm (E1%1cm = 233 )赤外線吸収スペクトル:赤外線吸収スペクトルは、試料をKBr錠剤法で測定する。
3425(cm-1)、2978、2937、2885、1624、1483、1444、1385、1358、1230、1151、1090、1047、951、930、879、835、779、723、710、621、552【0027】13C核磁気共鳴スペクトル:スペクトルは、重DMSOに溶解して測定する。化学シフトは、内部標準のテトラメチルシランを 0ppm とし、これとの比較値で示す。溶媒の重DMSOのシグナルは 39.0 〜 40.0ppmに出現する。化合物(B)のシグナルは、表6の通りで、マススペクトルのデータと一致し、10個の炭素が観測された。
【0028】
【表6】

【0029】1H核磁気共鳴スペクトル:スペクトルは、重DMSOに溶解して測定する。化学シフトは、内部標準のテトラメチルシランを 0ppm とし、これとの比較値で表7に示す。
【0030】
【表7】

【0031】これらの測定値から、化合物(B)は、次の化学式[化4]の化学構造を有すると認められる。
【0032】
【化4】

【0033】このことから、酸素及び好ましくはカタラーゼの存在下、1,5−アンヒドログルシトールにピラノースオキシダーゼ又はL−ソルボースオキシダーゼとアルドース−2−ウロースデヒドラターゼを作用させて生じる酸化生成物は、2(S)−(ヒドロキシメチル)オキサン−4,5−ジオン[化2]であり、さらにこの[化2]の化合物に2分子の水が付加した2(S)−(ヒドロキシメチル)−4,4,5,5−テトラヒドロキシオキサン[化3]を与えるものと推定された。 ここでカタラーゼを存在させた場合に生じる酸化生成物は、[化2]又は[化3]で示される化合物であり、これ以上酸化の進んだ生成物はほとんど認められない。
【0034】次に本発明の測定方法について説明する。1,5−アンヒドログルシトールを含む試料に酸素の存在下、前記の酵素を作用させるが、酸素は必ずしも供給する必要はなく、試料中などに存在する溶存酸素をそのまま利用してもよい。
【0035】ピラノースオキシダーゼ又はL−ソルボースオキシダーゼは、前記のものが使用でき、通常0.5〜500U/ml、好ましくは1〜200U/ml使用される。アルドース−2−ウロースデヒドラターゼも、前記のものが使用でき、通常0.5〜500U/ml、好ましくは1〜200U/ml使用される。カタラーゼは公知のものが使用可能であって、通常1〜10000U/ml、好ましくは100〜6000U/ml使用される。酵素反応は、酵素試薬を試料に添加し、通常15〜50℃で1分〜24時間、好ましくは3分〜30分間行われる。
【0036】次に、酵素反応で生成する2(S)−(ヒドロキシメチル)オキサン−4,5−ジオン[化2]、その水付加体である2(S)−(ヒドロキシメチル)−4,4,5,5−テトラヒドロキシオキサン[化3]を測定する方法について説明する。
【0037】2(S)−(ヒドロキシメチル)オキサン−4,5−ジオン[化2]は、反応基としてジケトンを持っている。ジケトンは、化学的な反応性に富み、たとえば、ヒドロキシルアミンやその誘導体と反応してジケトンのオキシム誘導体を、ヒドラジンやその誘導体と反応してジケトンのヒドラゾン誘導体を、カルバミン酸やその誘導体と反応してジケトンのカルバゾン誘導体を、芳香族アミンやその誘導体と反応してジケトンのシッフ塩基誘導体を、グアニジンやその誘導体と反応して蛍光誘導体を与えることが知られている。
【0038】一方、2(S)−(ヒドロキシメチル)オキサン−4,5−ジオン[化2]の水付加体である2(S)−(ヒドロキシメチル)−4,4,5,5−テトラヒドロキシオキサン[化3]は、容易に脱水して2(S)−(ヒドロキシメチル)オキサン−4,5−ジオン[化2]に戻り、2(S)−(ヒドロキシメチル)オキサン−4,5−ジオン[化2]と同様に反応する。
【0039】1,5AGの酵素による酸化反応によって生じる2(S)−(ヒドロキシメチル)オキサン−4,5−ジオン[化2]と、その水付加体である2(S)−(ヒドロキシメチル)−4,4,5,5−テトラヒドロキシオキサン[化3]は、そのまま測定してもよいが、好ましくは前記の反応などによって容易に吸光度の大きい色素や、高感度の蛍光物質等の誘導体に変換することができるので、適当な検出系を利用すればこれらの物質を精度よく定量することができる。したがって、精度よく1,5AGを測定することが可能となる。
【0040】
【実施例】以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【0041】実施例1〔13C標識2(S)−(ヒドロキシメチル)−4,4,5,5−テトラヒドロキシオキサンの製造〕
13C標識1,5AG 8.5mg 、ピラノースオキシダーゼとアルドース−2−ウロースデヒドラターゼの混合物 (宝酒造(株)製、ピラノースオキシダーゼ「タカラ」) 5mg、カタラーゼ (比活性 1,920U/mg) 1mg 、重水 0.1mlを 50mM リン酸緩衝液 (pH 6.0) 0.5ml に溶解し、37℃で3時間反応させた。
【0042】時間の経過とともに13C標識1,5AGは消失し、13C標識2(S)−(ヒドロキシメチル)−4,4,5,5−テトラヒドロキシオキサン[化3]が生成した。この反応液の13C核磁気共鳴スペクトルの測定結果は、前記の値と一致した。
【0043】実施例2〔2(S)−(ヒドロキシメチル)オキサン−4,5−ジオンのジO−エチルオキシムの製造〕
1,5AG 50mg 、ピラノースオキシダーゼとアルドース−2−ウロースデヒドラターゼの混合物 (宝酒造(株)製、ピラノースオキシダーゼ「タカラ」) 5mg、カタラーゼ (比活性 1,920U/mg) 1mg を 50mMリン酸緩衝液 (pH 6.0) 2.0mlに溶解し、37℃で12時間反応させた。この反応液にO−エチルヒドロキシルアミン塩酸塩 300mgを添加後、酢酸ナトリウム水溶液を滴下して反応液の pH を約4とし、室温下でさらに12時間反応させた。
【0044】得られた反応液に酢酸エチルを加えて生成物を酢酸エチル層に抽出後、抽出液を減圧乾固した。この乾固した残渣を精製水で溶解後、高速液体クロマトグラフィーにて精製し、約 35mg の2(S)−(ヒドロキシメチル)オキサン−4,5−ジオンのジO−エチルオキシム〔前記化合物(B):[化4]〕の結晶を得た。生成物についてのマススペクトル、紫外線吸収スペクトル、赤外線吸収スペクトル、核磁気共鳴スペクトルは、前記の値と一致した。
【0045】実施例3(1,5AGの測定)
1.0 、10.0、20.0、50.0mg/l濃度の1,5AG標準液および健常者の血清 100μl に、それぞれ、ピラノースオキシダーゼとアルドース−2−ウロースデヒドラターゼの混合物 (宝酒造(株)製、ピラノースオキシダーゼ「タカラ」)1mg/ml、カタラーゼ (比活性 1,920U/mg) 0.1mg/mlを溶解した 50mMリン酸緩衝液 (pH6.0) 500μl を添加し、37℃で3時間反応させた。
【0046】この反応液に、2(W/V) %濃度となるようにO−エチルヒドロキシルアミン塩酸塩溶液を添加後、室温下でさらに6時間反応させた。得られた反応液に、2mlの酢酸エチルを加えて2(S)−(ヒドロキシメチル)オキサン−4,5−ジオンのジO−エチルオキシムを酢酸エチル層に抽出後、抽出液を減圧乾固した。この乾固した残渣を精製水に溶解後、下記の高速液体クロマトグラフィーの条件下にて分析した。
【0047】
【表8】〔高速液体クロマトグラフィーの条件〕
装置 :LC10AT(島津(株)製)
分離カラム:センシューパックC18、6.0mmm内径×100mm (センシュー(株)製)
移動相 :A液:精製水、B液:80%アセトニトリル(グラジエント条件:0→30分でアセトニトリル0→50%)
流速 :1.5ml 分検出器 :SPD10、検出波長 263nm(島津(株)製)
注入量 :100μl【0048】この分析条件下で得られた1,5AGの検量線を、図1に示した。図1の検量線を用いて測定した健常者血清中の1,5AG値を表9に示した。また市販の1,,5AG測定用キット〔ラナAGキット(日本化薬 (株) 製)〕を使用して上記の健常者の血清中の1,5AG値を測定して表9に示した。両者の測定値はよく一致した。
【0049】
【表9】

【0050】
【発明の効果】以上説明した本発明によれば、1,5−アンヒドログルシトールの新規な酸化生成物が提供される。さらに当該生成物又はその誘導体を定量することにより1,5−アンヒドログルシトールを精度よく測定する方法が提供される。




 

 


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